ApoCⅢ對動脈粥樣硬化的影響及可能機制

高 藝 陳清光 阿布都卡地爾·阿不都拉 裴曉黎

(復旦大學附屬華東醫院心內科，上海 200000)

載脂蛋白(Apo)CⅢ是脂蛋白代謝中主要調節蛋白之一，可提高心血管疾病的發生風險。流行病學調查研究顯示，在T-455、SSTI等突變基因人群中ApoCⅢ高表達，血漿三酰甘油(TG)水平增加，心血管疾病發生風險明顯提升；而在R19x突變基因人群中ApoCⅢ低表達，血漿TG水平降低且高密度脂蛋白含量增加，冠心病發生風險降低〔1〕。ApoCⅢ作為一個獨立的促動脈粥樣硬化因子，過量表達可以導致高脂血癥并且促進動脈粥樣硬化的病變發展〔2〕。本研究探討ApoCⅢ對動脈粥樣硬化的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1動物與試劑 ApoCⅢ轉基因小鼠與LDLR小鼠雜交得到雙基因修飾小鼠。取10周齡雄性雙基因修飾小鼠12只為實驗組，LDLR小鼠12只為對照組，兩組均先普通飼料喂養1個月后用高脂飼料常規喂養3個月，斷髓處死后左心室注入固定液，取心臟和完整主動脈。主要試劑：8-前列腺素檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒、還原性谷胱甘肽檢測試劑盒均購于南京信帆生物技術有限公司；活性氧(ROS)熒光探針-二氫乙啶購于威格拉斯生物技術(北京)有限公司；鼠源單克隆抗體還原型輔酶Ⅱ氧化酶(NOX)-4、葡萄糖調節蛋白(GRP)78單克隆抗體購于上海聯碩生物科技有限公司；二抗購于上海恒斐生物科技有限公司。

1.2主動脈和流出道形態學檢測 顯微鏡視野下縱向剖開主動脈，觀察粥樣硬化斑塊沉積并進行油紅O染色，掃描染色呈陽性的區域并進行形態學定量，計算陽性面積；制備主動脈流出道，油紅O染色后計算粥樣硬化斑塊面積；選用平滑肌細胞特異性抗體SM22a染色和巨噬細胞特異性抗體MAC3染色觀察硬化斑塊分布情況。使用Leica Microsystems軟件對斑塊面積進行定量分析，用硬化斑塊面積與主動脈全長的面積的比值進行表示。

1.3血漿脂質和氧化應激指標檢測 兩組小鼠分別于普通飼料喂養1個月及高脂喂養3個月時，禁食6 h，肝素抗凝尾部采血，4℃恒溫5 000 r/min 離心10 min，分離血漿。酶法檢測總膽固醇(TC)和TG水平；酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血漿脂質過氧化物8-異前列腺素水平；比色法檢測MDA水平；酶法檢測還原性谷胱甘肽水平。

1.4主動脈ROS檢測 小鼠主動脈壁行ROS熒光探針-二氫乙啶染色，檢測ROS含量水平。二氫乙啶可自由透過活的細胞膜進入細胞內部，被細胞中的ROS氧化后生產二氫乙啶，滲入主動脈壁染色體中顯示紅色熒光。根據熒光數量可判斷ROS含量和變化。

1.5主動脈基因表達情況檢測 高脂喂養3個月后，使用蛋白和mRNA提取試劑盒，分別提取兩組小鼠主動脈總RNA和蛋白。RT-PCR檢測參與氧化應激基因mRNA表達情況，包括：纖溶酶原激活物抑制物(PAI)-1、NOX、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、p67；參與內質網應激基因mRNA表達情況，包括：GRP78、X盒結合蛋白(XBP)-1、增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)。Western印跡檢測氧化應激蛋白NOX-4和內質網應激蛋白GRP78的表達情況。

1.6統計學分析 應用SPSS15.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1兩組血漿中脂質水平比較 普通飼料喂養時實驗組小鼠血漿TG(8.35±2.40)mmol/L，明顯高于對照組〔(2.58±0.69)mmol/L，P<0.01〕；TC〔(10.91±2.23)mmol/L〕明顯高于對照組〔(6.82±0.95)mmol/L，P<0.05〕。高脂喂養3個月后，實驗組小鼠TG〔(6.63±2.47)mmol/L〕顯著高于對照組〔(1.83±0.76)mmol/L，P<0.01〕。實驗組和對照組TC〔(23.57±0.48)mmol/L〕、〔(21.66±2.20)mmol/L〕差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2兩組動脈粥樣硬化情況比較 高脂喂養3個月后，兩組主動脈全長染色均顯示出動脈粥樣硬化斑塊，其中實驗組主動脈流出道處硬化斑塊更為明顯(見圖1)。實驗組粥樣硬化斑塊面積〔(18.39±3.51)×104μm2〕明顯大于對照組〔(9.61±1.95)×104μm2，P<0.05〕。實驗組平滑肌細胞〔(11.26±2.85)×104μm2〕和巨噬細胞中硬化斑塊面積〔(15.34±1.96)×104μm2〕均明顯大于對照組〔(5.90±1.13)×104μm2、(8.65±2.07)×104μm2，P<0.05〕。見圖2。

圖2 兩組流出道動脈粥樣硬化病變情況(×40)

2.3兩組氧化應激和主動脈ROS水平 實驗組與對照組小鼠血漿脂質過氧化產物8-異前列腺素水平分別為(246.82±21.07)ng/L、(113.92±13.38)ng/L；MDA水平分別為(138.20±10.71)mol/L、(53.14±4.36)mol/L；還原性谷胱甘肽水平分別為(53.14±4.36)μmol/L、(138.20±10.71)μmol/L。實驗組與對照組主動脈壁ROS水平分別為〔(19.07±3.65)×104μm2〕、〔(9.25±1.36)×104μm2〕，見圖3。實驗組8-前列腺素、MDA、ROS水平明顯高于對照組，還原性谷胱甘肽水平明顯低于對照組(P<0.05)。

2.4兩組主動脈與內質網應激相關基因變化情況 實驗組氧化應激相關基因PAI-1、NOX、eNOS、SOD、p67 mRNA相對表達量顯著高于對照組，內質網應激相關基因GRP78、XBP-1、CHOP相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)。見表1。實驗組與對照組氧化應激相關基因NOX-4蛋白的相對表達量分別為(56.39±3.75)、(28.61±1.68)，內質網應激相關基因GRP78蛋白的相對表達量分別為(94.62±16.18)、(42.95±11.35)；實驗組NOX-4、GRP78蛋白表達量均顯著高于對照組(P<0.05)。

圖3 兩組主動脈二氫乙啶染色情況(×40)

表1 兩組主動脈與內質網應激相關基因mRNA表達水平

與對照組比較：1)P<0.05

3 討 論

ApoCⅢ被認為血脂異常、內皮功能障礙、炎癥和心血管疾病的共同關聯分子，可作為預測冠心病的危險因素〔3〕。本研究結果證實，ApoCⅢ高表達可獨立于血漿TC水平之外，對動脈粥樣硬化過程起明顯促進作用。研究發現，患者體內高氧化應激水平時，炎癥因子和血漿ApoCⅢ也處于高水平〔4〕。8-異前列腺素水平主要由自由基誘發不飽和脂肪酸過氧化反應后分泌的小分子脂類物質，為前列腺異構體。MDA是體內活性氧與多不飽和脂肪酸產生氧化反應生成的終產物。還原性谷胱甘肽是由3個氨基酸共同構成的小分子肽，在體內發揮重要的抗氧化和清除自由基作用，將體內有害物質轉出體外。Guettier等〔5〕認為，ApoCⅢ多態性位點能和脂肪酸結合蛋白2相互作用，從而導致代謝綜合征的發生率增加。最新研究顯示，代謝綜合征患者機體中極低密度脂蛋白(VLDL)分泌量增加，血漿ApoCⅢ水平提升，用該類患者血漿分離出的VLDL可有效促進內皮細胞ROS生成，誘發內皮細胞凋亡〔6〕。NOX介導的氧化應激可影響內皮祖細胞正常功能，在多種心血管疾病發展中起重要作用。本研究提示ApoCⅢ高表達可激活NOX、PAI-1、eNOS、SOD、 p67表達水平，進而促進動脈粥樣氧化斑塊的形成。相關研究顯示，氧化應激與內質網應激存在相關性〔7〕；一項對小鼠胰島細胞研究顯示，ApoCⅢ可提升高胰島β細胞中鈣離子水平并促進細胞凋亡，而細胞中鈣離子濃度增加與內質網應激也存在相關性〔8〕。本研究提示ApoCⅢ高表達可激活GRP78、XBP-1、CHOP表達水平，促進內質網應激水平，誘發動脈粥樣氧化斑塊的形成。

4 參考文獻

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