Kruppel樣因子8通過轉化生長因子-β1介導的上皮間質轉化促進胃癌細胞的侵襲轉移

李天梁 徐 亮 李蜀華 冷 尉

(西南醫科大學附屬醫院普外科，四川 瀘州 646000)

轉化生長因子(TGF)-β1是一類多功能細胞因子，參與了細胞分化、增殖、凋亡等生理過程，TGF-β1在多種病理過程中都大量表達，如慢性炎癥疾病〔1〕和癌癥〔2〕等。大量研究證實，在腫瘤微環境中，TGF-β1能夠促進血管生成、細胞外基質沉積、增加蛋白水解酶合成等〔3～5〕。此外，TGF-β1還能夠促進上皮間質轉化(EMT)，EMT是促進腫瘤惡性進展的主要機制之一。腫瘤細胞發生EMT的典型特點是其上皮標志蛋白鈣黏附蛋白E(E-cadherin)的表達降低和間質標志蛋白波形蛋白(Vimentin)表達增加。Kruppel樣因子(KLF)8屬于Kruppel樣C2H2鋅指轉錄因子家族成員之一，多種KLF家族成員被證實在腫瘤細胞中發揮著癌基因或者抑癌基因的功能，如KLF4、KLF5和KLF6。近來研究表明，KLF8在胃癌細胞中過量表達，并且在調節胃癌細胞增殖和侵襲中發揮著重要作用〔3〕，但是具體的機制并不清楚。已有研究證實KLF8與EMT之間存在聯系〔4〕，并且KLF8是TGF-β1的下游轉錄因子之一，參與腫瘤的形成、進展和EMT等過程〔5〕。然而，關于KLF8在胃癌中的研究相對較少。本研究旨在探討TGF-β1是否能夠促進胃癌細胞發生EMT，并且KLF8是否參與了TGF-β1介導的EMT，從而促進細胞侵襲轉移。

1 材料與方法

1.1細胞培養 人胃癌細胞株SGC7901和MKN45(中國上海科學院細胞庫)，培養于RPMI1640培養基中(含10% 胎牛血清，10×104U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素)，37℃，5%CO2條件下培養。TGF-β1處理組，即10 ng/ml TGF-β1，預處理胃癌細胞24 h，再進行后續實驗。

1.2脂質體轉染KLF8 siRNA 取4×105個處于對數生長期的MKN45細胞，接種于3.5 cm培養皿中，24 h后，采用脂質體Lipofectamine?3000(美國Invitrogen公司)將siKLF8(5′-CCGGCCCAGCACTGTTTAATGACATCTCGAGATGTCATTAAACAGTGCTGGGTTTTTG-3′)及siRNA無關序列(陰性對照組)(上海生工生物工程技術服務有限公司)轉染至MKN45細胞中，操作步驟參照試劑說明書。實驗分為空白對照(NC)組，siKLF8干擾組及陰性對照組

1.3熒光實時定量PCR(qRT-PCR) 收集各試驗組細胞約1×105個，各細胞樣品中加入1.0 ml Trizol(美國Thermo公司)，抽提細胞總RNA，按照RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)的說明書操作。紫外分光光度計(美國Thermo公司)檢測總RNA濃度及純度(A260/A280)，逆轉錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)進行逆轉錄。KLF8、E-cadherin、Vimentin及內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的qRT-PCR引物序列(上海生工生物工程股份有限公司)：KLF8正向5′-3′CTGCCTAATCTACCCAATCAGTTCA，反向5′-3′CTGGACAGTTGCTTATGGCATC；E-cadherin正向5′-3′GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA，反向5′-3′AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC；Vimentin正向5′-3′CACCTCTAAGGCCATCACCAGCTAACCAACGA，反向5′-3′TCAAGGTCAAGACGTGCCAGA；GAPDH正向5′-3′TGGTGAAGACGCCAGTGGA，反向5′-3′CTGAGAACGCACCGTCAAGG。定量PCR擴增儀(ABI 7500，美國ABI公司)檢測KLF8、E-cadherin、Vimentin表達水平。qRT-PCR擴增體系為10 μl，反應條件：50℃，2 min；95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，1 min，進行35個循環。采用2-ΔΔCt方法表示各基因mRNA相對表達量，重復3次獨立實驗后進行統計分析。

1.4Western印跡試驗 收集各試驗組細胞(2～5)×105個，加入RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)，抽提細胞全蛋白，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(美國Thermo公司)檢測蛋白濃度。10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白后，濕轉法將蛋白轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉1 h，Tris鹽酸緩沖液(TBS-T)洗膜，鼠抗人KLF8單克隆抗體(sc-134375，美國Santa公司，1∶1 000稀釋)，鼠抗人E-cadherin單克隆抗體(ab1416，美國Abcam公司，1∶1 000稀釋)，鼠抗人Vimentin單克隆抗體(ab8978，美國Abcam公司，1∶1 000稀釋)，兔抗人GAPDH單克隆抗體(sc-367714，美國Santa公司，1∶2 000稀釋)，4℃孵育過夜。TBS-T洗膜后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠二抗(上海英基生物科技有限公司，1∶10 000稀釋)，室溫孵育1 h，加電化學發光法(ECL)發光液(美國Millipore公司)進行化學發光顯影，凝膠成像儀(GelDoc-It，美國UVP公司)對蛋白條帶進行觀察，獲取圖像，并對圖像進行灰度分析(Image Lab軟件)，記錄灰度值，計算目的蛋白與內參蛋白的灰度比值。重復3次獨立試驗后，進行統計分析。

1.5細胞劃痕試驗 取對數生長期細胞(5～7)×105個，接種于6孔板中，24 h后，細胞匯合度達90%以上；使用移液器槍頭，垂直于6孔板底部，均勻劃線，每孔3條平行線；磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，去除漂浮的細胞，加入無血清RPMI1640培養基，37℃、5%CO2培養箱中正常培養，分別于0、24 h后顯微鏡(BX61，日本Olympus公司)下拍照，并計算細胞間距離。細胞間距離越大，說明遷移能力越低，重復3次獨立試驗后，進行統計分析。

1.6細胞侵襲試驗 24孔板中放置Transwell小室，在小室上層加入4.0 μg/μl Matrigel基質膠50 μl，37℃，5%CO2培養箱中過夜，使Matrigel基質膠凝固；在24孔板下室中加入500 μl的含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養液，Transwell小室中加入100 μl的各試驗組MKN45細胞懸液(細胞總數約1×105個)；48 h后，去除24孔板下室中的培養液，棉簽擦去Transwell小室內室膜上的細胞，0.1%結晶紫溶液染色，室溫5 min，顯微鏡(BX61，日本Olympus公司)下觀察，每孔隨機選取3個視野拍照，并記錄每個視野的細胞數目。重復3次獨立試驗后，進行統計分析。

1.7高內涵細胞分析試驗 處于對數生長期的MKN45細胞，接種于96孔板中，每孔5 000個細胞；24 h后棄去舊培養液，預冷PBS洗滌細胞2次，Heochst 33342對細胞進行熒光染色，15 min，預冷PBS洗滌2次，根據試驗分組，對細胞進行不同處理后，采用高內涵藥物篩選平臺(Cellomics Array Scan VTI 1700 plus，美國Thermo公司)檢測細胞72 h內的運動能力。重復3次獨立試驗后，進行統計分析。

1.8統計學方法 應用SPSS13.0軟件，計量資料采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1TGF-β1促進胃癌細胞EMT Western印跡試驗結果顯示，在胃癌細胞SGC7901和MKN45中，與NC組〔E-cadherin:(1.00±0.01),(1.20±0.02);Uimentin:(0.99±0.03),(0.71±0.03)〕細胞相比，TGF-β1處理組細胞內的E-cadherin表達量(0.25±0.02，0.21±0.02)顯著降低(t=44.126，52.679；均P=0.000)，而Vimentin的表達量(4.24±0.11，3.86±0.05)則顯著增加(t=48.668，83.527；均P=0.000)，見圖1A。本研究中，選擇MKN45細胞進行后續試驗。qRT-PCR結果顯示，TGF-β1處理組MKN45細胞中，E-cadherin mRNA表達水平(0.22±0.01)顯著低于NC組(1.01±0.01)，Vimentin mRNA表達水平(2.91±0.05)顯著高于NC對照組(0.99±0.03)(t=73.314，50.325；均P=0.000)。經TGF-β1處理后，MKN45細胞形態發生了顯著變化，見圖1B。以上實驗結果表明，TGF-β1能有效地減少上皮標志蛋白的表達，促進間質標志蛋白的表達，從而促進胃癌細胞EMT。

圖1 胃癌細胞中E-cadherin和Vimentin的表達

2.2TGF-β1誘導KLF8表達 qRT-PCR和WB試驗結果顯示，與NC組(1.01±0.03，1.00±0.02)相比，TGF-β1處理組MKN45細胞內KLF8 mRNA(2.14±0.15)和蛋白(2.43±0.07)表達水平分別增加了2.1倍和2.4倍。以上試驗結果表明，在胃癌細胞中，TGF-β1能夠誘導KLF8的表達。

2.3TGF-β1通過KLF8信號通路調節E-cadherin和Vimentin表達 脂質體轉染siKLF8，可降低MKN45細胞內KLF8的表達水平(NC組：1.02±0.02，陰性對照組：0.95±0.11，siKLF8干擾組：0.29±0.02；t=39.154，9.638，均P=0.000)。見圖2A。在此基礎上，檢測siKLF8處理組MKN45細胞內的E-cadherin和Vimentin表達量，結果顯示，siKLF8能夠部分逆轉TGF-β1的功能，導致E-cadherin表達上升，Vimentin表達下降，見圖2B，表1。以上試驗結果表明，TGF-β1能夠通過KLF8信號通路調節E-cadherin和Vimentin表達。

(1)MKN45；(2)MKN45+TGF-β1;(3)NC;(4)NC+TGF-β1;(5)siKLF8;(6)siKLF8+TGF-β1圖2 TGF-β1對各試驗組MKN45細胞中E-cadherin和Vimentin表達的影響

表1 siKLF8對TGF-β1功能的逆轉作用

2.4siKLF8逆轉TGF-β1介導的促遷移和侵襲能力 細胞劃痕試驗顯示，siKLF8處理組MKN45細胞的遷移能力比NC組和siKLF8陰性對照組明顯降低，且TGF-β1處理后，能夠顯著促進NC組和siKLF8陰性對照組MKN45細胞的遷移能力，然而，TGF-β1(10 ng/ml，預處理24 h)對siKLF8處理組MKN45細胞的遷移能力，則無明顯影響(P>0.05)。見圖3A，表2。

Transwell侵襲試驗結果顯示，與NC組和siKLF8陰性對照組相比，siKLF8處理組MKN45細胞的侵襲能力顯著降低；TGF-β1能夠顯著提高NC組和siKLF8陰性對照組的侵襲能力，但是TGF-β1對siKLF8處理組MKN45細胞的侵襲能力則無明顯影響(P>0.05)。見圖3B，表2。以上試驗結果表明，KLF8在TGF-β1介導的胃癌細胞侵襲和轉移中，發揮重要作用。

圖3 siKLF8對TGF-β1誘導的遷移和侵襲能力的影響

表2 siKLF8對TGF-β1誘導的遷移、侵襲能力的影響

2.5TGF-β1通過KLF8促進細胞的運動能力 高內涵細胞分析試驗結果顯示，48 h及72 h時，siKLF8處理組MKN45細胞的運動速度比NC組和siKLF8陰性對照組明顯下降；TGF-β1處理后，能夠顯著增加NC組和siKLF8陰性對照組運動速度，然而，TGF-β1對siKLF8處理組MKN45細胞的運動速度則無明顯影響(P>0.05)。見表3。

表3 各試驗組MKN45細胞的相對運動速度

與對應組的NC組和siKLF8陰性對照組比較：1)P<0.05；與對應的TGF-β1未處理組相比：2)P<0.05

3 討 論

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，具有高侵襲性，易遠處轉移等特點，這也是導致胃癌患者治療失敗，不良預后甚至死亡的重要原因〔6，7〕。因此，尋找與腫瘤遷移侵襲相關的靶蛋白，闡明他們促進遷移侵襲的機制，是臨床亟待解決的問題之一。胃癌細胞起源于腺上皮，具有上皮細胞的特征，但在某些因素的誘導下，胃癌細胞的上皮源性標志物E-cadherin表達下降，而間質性標志物Vimentin表達增加，使細胞從上皮細胞向間質細胞轉化，即EMT〔8〕。研究證實，EMT能夠促進腫瘤細胞的惡性進展〔9，10〕。TGF-β生長因子主要包括TGF-β1，TGF-2和TGF-β3，而TGF-β1在胃癌EMT過程中研究最為廣泛，TGF-β1除了參與調控細胞增殖和免疫應答以外，在腫瘤的發生和發展過程中也發揮著雙重作用，既能夠誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期，發揮抑制腫瘤的作用，又能夠促進腫瘤細胞發生侵襲轉移〔11，12〕。近年來的研究證實，KLF8是TGF-β1的下游因子，并且參與了細胞周期的調節，在腫瘤的形成和惡性進展中發揮著重要的作用。在多種腫瘤細胞中存在著KLF8的異常表達，如膀胱癌〔13〕、胰腺癌〔14〕、乳腺癌〔15，16〕等。

本研究表明TGF-β1刺激后，胃癌細胞中上皮標志蛋白的表達水平下降，而間質標志蛋白的表達水平增加，進而促進了胃癌細胞發生EMT。本研究也提示KLF8在TGF-β1誘導的一系列細胞變化中可能發揮作用。采用siKLF8干擾MKN45細胞內KLF8的表達后，能夠部分逆轉TGF-β1介導的降低E-cadherin、增加Vimentin表達，促進EMT的功能。本研究結果表明，TGF-β1能夠增加細胞的遷移和侵襲能力，而在siKLF8組MKN45細胞中，TGF-β1并不能夠促進細胞遷移和侵襲，即在胃癌細胞中，KLF8作為TGF-β1下游的效應分子，參與了TGF-β1介導的增強細胞遷移和侵襲的過程。

綜上所述，TGF-β1能夠誘導胃癌細胞發生EMT，并且TGF-β1能夠誘導細胞內KLF8的表達；在胃癌細胞中，TGF-β1/KLF8信號通路激活后，細胞的遷移和侵襲能力顯著增強；KLF8作為TGF-β1誘導EMT過程中的關鍵下游效應分子，在胃癌細胞的遷移和侵襲中發揮著極其重要的作用，TGF-β1/KLF8信號通路有可能作為逆轉胃癌細胞EMT的作用靶標。

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