右美托咪啶對腎缺血再灌注損傷大鼠腎功能及肺組織Toll樣受體4蛋白表達的影響

趙 亮 黃麗娟 宋麗莉 趙展琦 王鑫凱 王忠群 叢威亮

(齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院麻醉科，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

缺血/再灌注損傷(IRI)為臨床高發(fā)病理癥狀，腎移植手術或多種大型手術圍術期所發(fā)生的腎缺血再灌注損傷(RIRI)非常典型且嚴重，受到醫(yī)療工作者的高度關注〔1〕。研究證實，RIRI與其他傳統(tǒng)類型腎臟損傷相對比，損傷更加復雜，并且臨床病死率較高，這可能與腎外器官發(fā)生功能障礙有關〔2〕。RIRI不但會影響腎功能情況，還會引發(fā)一定程度肺功能障礙，并且腎受損程度與肺功能障礙二者間存在一定相互促進關系〔3，4〕。雖然RIRI造成腎外器官肺發(fā)生功能障礙具體機制仍未明確，但是目前研究結果顯示其和機體應激發(fā)生的炎癥反應密切相關，Toll樣受體(TLR)4蛋白可能是這個過程中的關鍵因子，TLR4可以和脂多糖結合蛋白結合，激活下游信號通路蛋白，導致炎癥因子分泌增加〔5〕。右美托咪定(Dex)作為新型高選擇性α2類型受體激動藥物，可有效降低RIRI情況，但有關該藥對于腎臟及對遠隔器官等發(fā)揮保護作用的具體分子機制仍需要深入探討〔6〕。本研究通過分析Dex對RIRI大鼠腎功能及肺組織TLR4蛋白的影響，旨在提供更加詳實的數(shù)據(jù)支持。

1 資料和方法

1.1一般資料 選擇2017年7月醫(yī)院飼養(yǎng)的80只體重250～300 g的清潔級SD雄性大鼠，按照隨機數(shù)字表法分成對照組、I/R組(缺血再灌注組)、預處理組(給予Dex預處理)及后處理組(給予Dex后處理)，每組20只。對照組僅對大鼠實施右腎切除，I/R組行右腎切除后，使左腎缺血約45 min，而后灌注1 h制成RIRI模型。預處理組在對大鼠實施股靜脈穿刺之后為其泵注劑量為1 μg/kg的Dex，在10 min后將劑量改成0.5 μg/kg，給予泵注30 min后到缺血即刻時停止。后處理組從大鼠的左腎再灌注開始經(jīng)靜脈泵注劑量為1 μg/kg的Dex，在10 min后將劑量改成0.5 μg/kg，在泵注30 min后停止。

1.2模型制作 大鼠術前禁食、水6 h，而后10%水合氯醛腹腹注射，劑量為3 mg/kg。行腹中線4～5 cm縱切口，暴露腹腔，使小腸、結腸、脾臟移到左側，分離右腎，結扎腎蒂，將右腎取出。而后再將小腸、結腸及脾臟移到右側，充分顯露出左側的腎臟及左腎蒂，通過無損傷血管夾夾閉腎蒂45 min后松開血管夾，恢復血液灌注，如腎臟由暗紫色變?yōu)榧t色則表示I/R模型復制成功，縫合并關閉腹腔。

1.3標本檢測 在模型建立成功后的6 h對各組大鼠進行尾靜脈取血3 ml，3 000 r/min離心15 min，提取上清液，將其加入1.5 ml離心管內，放在-80℃下保存待測。通過購自貝克曼庫爾特公司的AU680型全自動生化分析儀及附帶試劑測定大鼠血清尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)水平，并應用購自深圳的晶美工程公司的酶聯(lián)免疫(ELISA)法試劑盒測定血清白細胞介素(IL)-6及IL-1β水平，有關操作步驟均嚴格遵照說明書的描述進行。實驗結束時，將大鼠處死，取腎組織及肺組織進行制片，顯微鏡下觀察大鼠腎和肺的組織學變化。通過免疫組化的PV6001二步法及購自北京的中杉公司的試劑盒和購自武漢博士德公司的TLR4兔抗大鼠型多克隆抗體測定肺組織的TLR4蛋白表達水平，將每張切片置于10×40倍的光鏡下，任選10個視野，通過Olympus BX14圖像分析系統(tǒng)實施人工分析，統(tǒng)計時不計染色強度，針對每個高倍鏡的視野依次實施陽性細胞的計數(shù)，算出平均值為陽性表達水平。

2 結 果

2.1各組大鼠腎功能指標的對比 與對照組相比，I/R組的腎臟損傷更為嚴重，且炎癥明顯，存在腎小管擴張、充血及水腫，肺組織呈炎性細胞的浸潤，在肺泡四周可見毛細血管出血及肺間質型水腫。而Dex預處理組及后處理組的腎臟損傷和炎癥均緩解，細胞異常形態(tài)較少，肺泡結構比較清晰，病理變化明顯改善。各組大鼠Scr和BUN水平組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。I/R組、預處理組及后處理組的Scr和BUN水平均明顯高于對照組，而預處理組及后處理組的Scr和BUN水平均明顯低于I/R組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。但預處理組及后處理組的Scr和BUN水平相比，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表1。

2.2各組大鼠血清IL-6和IL-1β水平的對比 各組大鼠的血清IL-6和IL-1β水平相比，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。I/R組、預處理組及后處理組的IL-6和IL-1β水平均明顯高于對照組，而預處理組及后處理組的IL-6和IL-1β水平均明顯低于I/R組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。但預處理組及后處理組的IL-6和IL-1β水平相比，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表2。

表1 各組大鼠腎功能指標對比

與對照組相比：1)P<0.05；與I/R組相比：2)P<0.05，下表同

表2 各組大鼠血清IL-6和IL-1β水平對比

2.3各組大鼠肺組織TLR4蛋白的表達對比 各組大鼠的肺組織TLR4蛋白的表達水平相比，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。I/R組(92.34±23.68)、預處理組(69.83±11.24)及后處理組(70.13±13.65)的TLR4蛋白表達明顯高于對照組(1.01±0.32)，而預處理組及后處理組的TLR4蛋白表達水平均明顯低于I/R組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。但預處理組及后處理組的TLR4蛋白表達水平相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。I/R組、預處理組及后處理組的TLR4蛋白表達水平相比，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

2.4大鼠肺組織TLR4蛋白表達水平與腎功能及IL-6和IL-1β水平的相關性分析 大鼠肺組織TLR4蛋白表達水平與Scr、BUN、IL-6及IL-1β均呈正相關(r=0.688，0.710，0.696，0.724；均P=0.000)。

3 討 論

目前有關RIRI具體發(fā)病機制尚不明確。研究表明，當腎組織內發(fā)生缺血情況時其血流量會下降，進而導致腎臟處于缺氧環(huán)境，發(fā)生再灌注之后雖然缺血組織得到血流恢復，但是因其能量代謝功能出現(xiàn)障礙、細胞通透性受到影響，而易誘發(fā)炎癥反應、加重組織受損情況〔7，8〕。同時，再灌注階段的氧化應激反應會產(chǎn)生大量活性氧簇(ROS)，ROS能夠刺激促炎細胞大量產(chǎn)生，進而引發(fā)中性粒細胞及巨噬細胞等向腎臟及其遠隔器官趨化并發(fā)生浸潤。并且機體在IRI之后會出現(xiàn)炎癥反應，生成的炎癥因子能夠激活下游有關凋亡的信號通路，使得細胞最終受到損傷甚至發(fā)生凋亡。而極易受到影響的肺器官也可以表達有關促凋亡因子，并且通過胞吐形式分泌到機體內，加重腎功能損傷，以此形成惡性循環(huán)。研究發(fā)現(xiàn)，α2受體可分布在腎臟以及周身組織器官中，而Dex屬于α2受體激動藥，能夠借助激活突觸前內α2受體來發(fā)揮鎮(zhèn)靜以及抗炎等功效，可能有利于降低圍術期RIRI發(fā)生率〔9，10〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，Dex預處理組及后處理組對大鼠腎臟和肺損傷均具有改善作用，病理變化明顯改善，提示Dex處理能夠改善RIRI大鼠的腎功能，原因可能與Dex的作用機制有關。動物實驗研究表明，應用Dex治療RIRI，可有效抑制大鼠血管加壓素大量分泌，從而幫助腎器官加大血流灌注，以提升腎小球濾過率，降低RIRI之后腎功能受損程度〔11〕。同時，Dex能夠激活細胞抗凋亡信號通路，進而提升細胞存活率，使得從缺氧狀態(tài)下恢復到供氧狀態(tài)的腎臟細胞受到保護。因此，Dex既能夠對腎臟RIRI之后所發(fā)生的血管痙攣情況進行調節(jié)，維護腎臟功能，又可以對腎小管中上皮細胞自身抗凋亡型信號通路進行激活，保護其細胞，進而起到降低腎損傷的療效〔12〕。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，Dex處理能夠減少RIRI大鼠機體的炎癥因子水平。原因主要可能是因為Dex有抑制RIRI之后肺組織上炎癥因子產(chǎn)生及釋放的功效，進而起到保護肺器官作用。本研究中Dex處理能降低RIRI大鼠肺組織中TLR4蛋白的表達。TLRs屬于先天免疫系統(tǒng)內細胞跨膜類受體及病原模式類型識別受體，通常在急性炎性反應自身調節(jié)以及細胞間信號傳導或者細胞凋亡等過程中發(fā)揮作用。TLR4就是其中一種受體，其功能在于當其信號通路受到激活之后可以激發(fā)多類炎性因子轉錄及合成，因此，TLR4和炎性因子生成關系密切〔13〕。本文提示可通過監(jiān)測TLR4蛋白的表達反饋出機體其他器官的狀態(tài)及炎癥，Karahan等〔14〕的報道中也得出了類似結論。綜上所述，Dex對RIRI大鼠的腎功能和炎癥水平均具有改善作用，并降低肺組織TLR4蛋白的表達，且肺組織TLR4蛋白的表達與腎功能及炎癥指標具有緊密的聯(lián)系，臨床可考慮將其作為新型監(jiān)測靶點。

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