香榧不同部位提取物的抗氧化和酶抑制活性比較分析

張 露，劉鵬飛，涂宗財,,*，謝 星，張恕雅，沙小梅，王 輝，戴花劍

（1.江西師范大學生命科學學院，江西 南昌 330022）2.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

香榧（Torreya grandis cv. Merrillii）為紅豆杉科榧屬常綠喬木，又稱細榧、榧子、玉榧，是我國特有、世界稀有的經濟樹種。香榧除了加工成堅果類食品作為美食佳品外，還是名貴中藥材，入藥具有延緩衰老、清肺潤腸、止渴化痰、消積通便等功效[1]，但關于香榧的生物活性及其化學組成的研究比較少。藥理學研究顯示，香榧仁提取物及其萃取組分具有較好的抗氧化[2]、預防動脈粥樣硬化[3]功能；香榧葉具有抗炎和鎮痛作用[4]；香榧假種皮提取物具有抗腫瘤、抑制艾滋病病毒生長和抗氧化的作用[5-6]。Saeed等[4]報道，香榧葉中含有生物堿、黃酮、單寧、萜類和皂苷類化合物。何關福等[7]從香榧葉中鑒定出了榧屬植物的特征成分榧黃素；于勇杰等[8]發現二萜類物質為香榧假種皮提取物的主要成分，其次為倍半萜類和單萜類物質；周大錚[5]從香榧假種皮中分離鑒定了8 種二萜類化合物和8 種木質素類化合物。但目前還鮮見報道對香榧葉、莖、假種皮、種殼和種仁中活性成分的含量進行比較，也鮮見關于香榧降血糖和抗痛風活性方面的報道。

本實驗以香榧葉、香榧莖、香榧假種皮、香榧殼和香榧仁為原料，分別分析90%乙醇溶液提取物中總酚、總黃酮和縮合單寧的含量，通過1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-聯氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）自由基清除能力2 個體外抗氧化模型，以及α-葡萄糖苷酶活性抑制能力和黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）活性抑制能力評價香榧不同部位活性成分含量，及其提取物的抗氧化、降血糖和抗痛風能力，為香榧資源的高效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮的香榧葉、莖和種子于2016年9月29日采集于江西省撫州市黎川縣香榧種植基地，采后的原料用自來水沖洗后，將種子的假種皮、種殼和種仁分開，冷凍干燥，粉碎，最后于4 ℃保存。

Folin-Ciocalteu試劑、Na2CO3、AlCl3、沒食子酸、槲皮素 上海晶純生化科技股份有限公司；ABTS、DPPH、阿卡波糖、α-葡萄糖苷酶（來源于酵母，EC 3.2.1.20）、XOD（來源于牛奶）、黃嘌呤、別嘌呤醇和p-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG） 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SynergyH1酶標分析儀 美國BioTek公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；TGL-10C高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；ML104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

準確稱取1.5 g香榧葉、莖、假種皮、種殼和香榧仁粉末，以90%乙醇溶液為溶劑按1∶20（g/mL）的固液比，500 W、50 ℃超聲處理1.0 h，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，殘渣再在相同條件下提取2 次，合并上清液，旋轉濃縮后用90%甲醇溶液定容至25 mL，4 ℃冰箱保存用于后續分析。

1.3.2 總酚含量測定

采用Folin-Ciocalteu法測定提取液中總酚的含量[9]。分別取200 μL稀釋后的樣品溶液和0.1 mL Folin-Ciocalteu試劑于試管中，搖勻，5 min后加入0.3 mL 20% Na2CO3溶液和1.0 mL蒸餾水，室溫避光反應25 min后4 000 r/min離心5 min，然后取200 μL于96 孔酶標板中用酶標儀測反應體系在波長765 nm處的吸光度Ai，以加樣品不加20% Na2CO3溶液的反應體系為樣品空白Aj，樣品的吸光度為ΔA=Ai－Aj。以沒食子酸（40～120 μg/mL）為標準品繪制標準曲線，結果表示為毫克沒食子酸當量（gallic acid equivalent，GAE）每克干原料（mg GAE/g）。實驗重復3 次。

1.3.3 總黃酮含量測定

采用AlCl3法測定樣品中的總黃酮含量[10]。分別準確取0.1 mL適宜濃度的樣品溶液與0.1 mL 2% AlCl3·6H2O（甲醇配制）于96 孔酶標板中混勻，室溫反應15 min后于波長430 nm處測吸光度Ai。以0.1 mL甲醇代替AlCl3·6H2O的體系為樣品空白Aj，樣品的吸光度為ΔA＝Ai－Aj。以槲皮素為標準品（5.0～40.0 μg/mL）繪制標準曲線，結果表示為毫克槲皮素當量（quercetin equivalent，QuE）每克干原料（mg QuE/g）。實驗重復3 次。

1.3.4 縮合單寧含量測定

采用香草醛法[11]測樣品中縮合單寧的含量。取0.5 mL稀釋到適宜濃度的樣品與3.5 mL新鮮配制的1%香草醛溶液（7 mol/L H2SO4配制）混合，避光反應15 min后用紫外-可見分光光度計測體系在波長500 nm處的吸光度Ai。以3.5 mL 7 mol/L H2SO4代替香草醛溶液的體系為樣品空白Aj，樣品的吸光度為ΔA=Ai－Aj。以兒茶素（50～250 μg/mL）為標準品繪制標準曲線，樣品中縮合單寧含量表示為毫克兒茶素當量（catechin equivalent，CE）每克干原料（mg CE/g）。實驗重復3 次。

1.3.5 DPPH自由基清除能力測定

參照前期研究方法，采用DPPH自由基清除能力實驗比較不同樣品的自由基清除能力[12]。以槲皮素為陽性對照，結果用抑制率表示。樣品清除50%的DPPH自由基所需要的樣品質量濃度用IC50值表示（mg/mL），以干基計。所有實驗重復3 次。

1.3.6 ABTS＋·清除能力

采用ABTS＋·清除能力實驗評價樣品的總抗氧化能力[13]。首先將38.4 mg ABTS和6.623 mg過硫酸鉀混合定容至10 mL配制成ABTS母液，室溫避光反應12～16 h后用甲醇稀釋至溶液在波長734 nm處的吸光度為7.0±0.2左右。分別取30 μL稀釋到適宜濃度的樣品與220 μL ABTS溶液于96孔酶標板中混合，避光反應6 min后于波長734 nm測吸光度，以槲皮素為陽性對照，結果用抑制率表示。清除50%的自由基所需要的樣品質量濃度用IC50值表示（mg/mL），以干基計。所有實驗重復3 次。

1.3.7 α-葡萄糖苷酶活性抑制能力

參照費群勤等[14]的方法測定樣品對α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力。50 μL不同濃度的樣品或阿卡波糖和50 μL 0.1 U α-葡萄糖苷酶（用0.1 mol/L，pH 6.9磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）配制）于96 孔酶標板中混勻，25 ℃反應10 min后分別加入50 μL 5 mmol/L PNPG溶液（用0.1 mol/L，pH 6.9的PBS配制），室溫反應30 min后加100 μL 0.2 mol/L Na2CO3溶液終止反應，最后于波長405 nm處測吸光度Ai。以90%乙醇溶液代替樣品的反應體系為控制組（Ac），以PBS代替酶液的反應體系為樣品空白組（Aj），以90%乙醇溶液和PBS分別代替樣品和酶液的體系為空白（Ab）。所有測定平行3 次，抑制50%的酶活所需要的樣品質量濃度用IC50值表示（mg/mL），以干基計，酶活性抑制能力按公式（1）計算：

1.3.8 XOD活性抑制能力

參照El Euch等[15]的方法評價樣品對XOD活性的抑制能力。先后將60 μL 70 mmol/L，pH 7.5的PBS與50 μL適宜濃度的樣品溶液和50 μL 0.1 U/mL的XOD加在96 孔酶標板中，25 ℃反應15 min后加入60 μL 150 μmol/L的黃嘌呤，25 ℃反應5 min后于波長295 nm處測吸光度Ai，以90%乙醇溶液代替樣品的反應體系為控制組（Ac），以PBS代替酶液的反應體系為樣品空白組（Aj），以90%乙醇溶液和PBS分別代替樣品和酶液的體系為空白（Ab）。以別嘌呤為標準品，所有實驗重復3 次，抑制50%的酶活所需要的樣品質量濃度用IC50值表示（mg/mL），以干基計。酶活性抑制能力的計算同公式（1）。

1.4 數據處理

采用Origin 8.0軟件計算樣品清除自由基或抑制酶活性的IC50值，采用SPSS 19.0中的單因素方差分析（ANOVA）分析數據間的顯著性差異（P＜0.05），所有結果用 ±s表示。采用皮爾森相關性分析方法評價總酚、總黃酮和縮合單寧含量與抗氧化和酶抑制活性之間的相關性。

2 結果與分析

2.1 總酚、總黃酮和縮合單寧含量分析

圖1 香榧不同部位樣品中總酚、總黃酮和縮合單寧含量Fig. 1 Contents of total phenolics, total flavonoids and total tannins of samples from different parts of Chinese torreya

由圖1可知，香榧不同部位提取物中的總酚含量差別很大，其含量順序為：香榧仁（25.28 mg GAE/g）＞香榧葉（11.1 mg GAE/g）＞香榧莖（4.23 mg GAE/g）＞香榧假種皮（2.62 mg GAE/g）＞香榧殼（0.65 mg GAE/g）。香榧仁提取液中的總酚含量最高，香榧殼提取液中的總酚含量最低，只有香榧仁的2.57%。由此可知，多酚類物質主要存在于香榧的果仁之中。

如圖1所示，不同香榧樣品中總黃酮含量的變化趨勢與總酚含量不同，香榧假種皮和香榧莖提取液中的黃酮含量最高，為0.55～0.56 mg QuE/g，且兩者間不存在顯著性差異（P＞0.05），香榧葉中的總黃酮含量次之，為0.26 mg QuE/g，香榧殼中的總黃酮含量最低，僅為香榧假種皮的8.93%。由此可知，香榧中的黃酮類物質主要存在于香榧假種皮和香榧莖之中。這可能是因為香榧假種皮、香榧莖和香榧葉長期暴露于外部環境，氧化應激、光合作用等條件促使這些部位合成更多的黃酮類化合物。Carvalhoa等[16]表明長的光照周期有利于促進甘薯葉中黃酮類化合物的合成。Azuma等[17]發現，低溫和光照條件處理均可大大提高葡萄果肉中黃酮類化合物合成相關基因的表達。

由圖1可知，不同香榧部位樣品中的縮合單寧含量的差異很大，其變化范圍為0.06～1.10 mg CE/g。香榧葉提取液具有最高的縮合單寧含量，為1.10 mg CE/g，其次為香榧仁0.55 mg CE/g ，香榧莖中的縮合單寧含量最低（0.06 mg CE/g），只有香榧葉的5.45%。因此，香榧中的縮合單寧類物質主要存在于香榧葉中。

2.2 抗氧化活性評價

活性氧自由基（reactive oxide species，ROS）是生物新陳代謝的正常產物，但是機體中過多的ROS會導致活細胞中蛋白質、DNA和其他生物大分子的損傷，從而產生一系列退化性疾病，如癌癥、心血管疾病、中風、糖尿病、代謝紊亂、腦功能障礙和免疫功能下降等[18-19]。研究證明，抗氧化劑是降低機體中活性氧自由基過多的一種有效方法，但合成性抗氧化劑如二丁基羥基甲苯、沒食子酸丙酯，對機體具有致癌和致誘變的副作用[20-21]。植物中的抗氧化活性成分——多酚類化合物是天然的抗氧化劑資源，且具有綠色、高效和無毒副作用的特點[22-23]。因此研究植物的抗氧化活性成分及其能力對預防糖尿病及其并發癥具有重要意義。

2.2.1 DPPH自由基清除能力測定結果

圖2 香榧不同部位樣品的DPPH自由基清除能力Fig. 2 DPPH radical scavenging ability of samples from different parts of Chinese torreya

表1 香榧不同部位DPPH自由基清除能力、ABTS＋ ·清除能力、α-葡萄糖苷酶和XOD活性抑制能力的IC50值Table 1 IC50 values for DPPH radical scavenging ability, ABTS＋·scavenging ability, and α-glucosidase and XOD inhibitory activity of different parts of Chinese torreya mg/mL

采用DPPH自由基清除能力體外模型比較香榧不同部位的抗氧化能力，如圖2所示，其IC50值如表1所示。在測試質量濃度范圍內（0.05～30 mg/mL），所有樣品均具有較好的DPPH自由基清除能力，且其清除能力隨樣品質量濃度的增加逐漸增加。香榧仁具有最高的DPPH自由基清除能力，其IC50值為0.48 mg/mL，其次為香榧葉（1.19 mg/mL），香榧殼的DPPH自由基清除能力最低，其值約為香榧葉的16 倍，這可能是與香榧仁中最高的總酚含量和較高的縮合單寧含量有關。相關性分析表明，香榧不同部位提取物的DPPH自由基清除能力與總酚、總黃酮和縮合單寧含量的相關系數分別為0.817、0.041和0.667，表明酚類化合物對樣品的DPPH自由基清除能力的貢獻最大，其次為縮合單寧類化合物，由此初步推斷酚類化合物為香榧中主要的自由基清除劑。Shi Haiming等[2]也發現香榧仁具有較好的抗氧化能力，酚類化合物為其主要活性成分。

2.2.2 ABTS＋·清除能力測定結果

圖3 香榧不同部位樣品的ABTS＋·清除能力Fig. 3 ABTS＋· scavenging ability of samples from different parts of Chinese torreya

為驗證DPPH自由基清除能力實驗得到的結果，進一步采用ABTS＋·清除能力實驗比較香榧不同部位提取物的抗氧化活性，如圖3所示。當樣品質量濃度低于3.75 mg/mL時，所有樣品對ABTS＋·的清除能力呈明顯的量效關系，且其變化趨勢總體上與DPPH自由基清除能力相似。香榧不同部位樣品清除ABTS＋·的IC50值的變化趨勢為：香榧仁（0.53 mg/mL）＜香榧葉（0.90 mg/mL）＜香榧莖（1.65 mg/mL）＜香榧假種皮（2.24 mg/mL）＜香榧殼（15.35 mg/mL）。因此，香榧仁具有最高的ABTS＋·清除能力，香榧殼的ABTS＋·清除能力最低。但按照干原料的質量計算時，香榧樣品的自由基清除能力均低于陽性對照品槲皮素。相關性分析表明，ABTS＋·清除能力與樣品中總酚和縮合單寧的含量具有較高的相關性系數，相關系數分別為0.534和0.536，而黃酮含量與ABTS＋·的清除能力呈弱相關（r=0.337），表明酚酸和縮合單寧類化合物為香榧中清除ABTS＋·的主要作用成分。

2.3 降血糖潛力評價

α-葡萄糖苷酶是位于人小腸上皮細胞膜表面的碳水化合物水解酶，它通過將低聚糖或二糖水解為人體可吸收的單糖來促進人體對碳水化合物的吸收，當其活性被抑制時，能有效降低碳水化合物的消化速率，從而降低餐后和空腹血糖水平[24]。天然、高效、無毒副作用的α-葡萄糖苷酶抑制劑被稱為糖尿病學上“未開發的鉆石”[25]，被推薦為糖尿病一線治療藥物[26]。因此，采用α-葡萄糖苷酶活性抑制能力實驗評價香榧不同部位的降血糖潛力，如圖4所示。

圖4 香榧不同部位樣品的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力Fig. 4 α-Glucosidase inhibitory activity of samples from different parts of Chinese torreya

由圖4可知，當α-葡萄糖苷酶活性的抑制率低于90%時，香榧仁和香榧殼提取物的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力隨著樣品質量濃度的增加而增加，但香榧莖和香榧假種皮提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力隨樣品質量濃度的升高增加較緩慢，且在測試樣品質量濃度范圍內（0.94～30 mg/mL）兩者之間的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力相差不大，而香榧葉提取物不存在α-葡萄糖苷酶活性抑制能力。香榧仁提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的IC50值最低，僅為0.14 mg/mL，遠低于糖尿病臨床治療藥物阿卡波糖的1.29 mg/mL，因此，香榧仁具有最高的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力，可作為一種潛在的天然降血糖活性成分資源。相關性分析表明，樣品的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力與總酚、總黃酮、縮合單寧含量的相關系數分別為0.568、0.895和0.733，表明黃酮類化合物對香榧仁抑制α-葡萄糖苷酶活性的貢獻最大，其次為單寧類化合物。

2.4 XOD活性抑制能力

XOD是核酸代謝過程中一種重要的復合性黃素蛋白酶，它能催化體內的次黃嘌呤和黃嘌呤產生尿酸和過氧化物自由基。當機體中XOD的活性較高時，就會導致尿酸的大量生成，最終導致高尿酸血癥及痛風[27]。機體長期高尿酸水平會增加糖尿病、高血脂、肥胖、腎結石、高血壓和心臟病等多種疾病發病率[28-29]。降低尿酸水平的有效方法之一是利用XOD抑制劑降低XOD的活性，從而降低黃嘌呤、次黃嘌呤轉化為尿酸的反應速率[30]。因此采用XOD活性抑制實驗評價香榧不同部位提取物在痛風和高尿酸血癥預防和治療方面的應用前景。

圖5 香榧不同部位樣品的XOD活性抑制能力Fig. 5 Xanthine oxidase inhibitory activity of samples from different parts of Chinese torreya

由圖5可知，香榧仁提取物具有相對較強的XOD活性抑制能力，當樣品質量濃度為0.94～15.00 mg/mL時，其活性隨樣品質量濃度的增加逐漸增加，IC50值為3.07 mg/mL，但該值遠高于陽性對照物別嘌呤醇（IC50值為9.15 μg/mL）。香榧假種皮提取物的XOD活性抑制能力較弱，其IC50值均大于15 mg/mL，而香榧葉、香榧莖和香榧殼提取物沒有XOD活性抑制能力。這可能取決于香榧仁中高的總酚和縮合單寧含量。以質量濃度為7.5 mg/mL時樣品的XOD活性抑制能力進行相關性分析發現，總酚、總黃酮和縮合單寧含量與XOD活性抑制能力的相關系數分別為0.745、0.032和0.562，表明酚酸和單寧類化合物為香榧仁中主要的抑制XOD活性的作用成分。

3 結 論

本實驗比較了香榧的葉、莖、假種皮、種殼和種仁提取物中總酚、總黃酮和縮合單寧含量以及體外抗氧化活性的差異，并首次分析了香榧不同部位提取物對α-葡萄糖苷酶和XOD活性的抑制能力。結果表明，香榧仁提取物是優于香榧葉、莖、假種皮和種殼的天然抗氧化劑、α-葡萄糖苷酶和XOD抑制劑資源。香榧仁中的主要活性成分為酚類化合物，其次為縮合單寧類；香榧葉中的主要活性成分為縮合單寧類化合物，其次為酚類；香榧莖和香榧假種皮中的活性成分主要為黃酮類化合物。香榧仁具有較好的DPPH自由基和ABTS＋·清除能力，及α-葡萄糖苷酶活性和XOD活性抑制能力，且活性高于香榧的葉、莖、假種皮和種殼。同時，香榧仁對α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力約為糖尿病臨床治療藥物阿卡波糖的9.21 倍，但自由基清除能力和XOD抑制能力低于陽性對照品。酚酸和縮合單寧類化合物對香榧的抗氧化和XOD抑制活性起主要作用，黃酮和縮合單寧類化合物對樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性起主要作用。但香榧仁中的具體作用成分需要進一步深入研究。

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