剁辣椒中優良乳酸菌的分離鑒定及其生物學特性分析

葉 陵，李 勇，王蓉蓉，劉成國，蔣立文，鄧放明，周 輝,*

（1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南省食品科學與生物技術重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.張家界靈潔綠色食品有限公司，湖南 張家界 427000）

我國是辣椒最大的生產國，辣椒的初加工主要有干制、腌制、油制、泡漬等，其中腌制辣椒包括剁辣椒、泡辣椒、辣椒醬等發酵辣椒產品。發酵是蔬菜的一種最簡單和方便的加工保存方法[1]，自然發酵辣椒主要是利用其天然辣椒表面附著的乳酸菌進行的發酵，經過乳酸菌厭氧發酵以后，其味酸辣、可口，并且具有開胃的功能。

剁辣椒屬于發酵辣椒，其傳統加工方法是利用乳酸菌的自然發酵和食鹽保存作用進行加工處理，目前剁辣椒加工企業普遍采用20%以上的高鹽腌制辣椒的方法進行加工，這樣雖然可保留辣椒的色澤、辣味和脆度，但是產品沒有發酵辣椒特有的風味和香氣，而且加工食用前要經過脫鹽處理，這樣增加了生產成本，同時也造成了環境的污染。因此，選用安全、耐鹽、耐酸同時具有亞硝酸鹽降解能力的優良乳酸菌進行辣椒的接種發酵，成為提高發酵辣椒品質的重要途徑。

目前從剁辣椒中分離出的乳酸菌主要是植物乳桿菌、短乳桿菌、戊糖片球菌等，但以乳桿菌為主[2-6]，由于已有研究分離的剁辣椒樣本較少，分離出的乳酸菌數量少，分離乳桿菌的發酵產酸、降解亞硝酸鹽、耐鹽、耐酸及安全性等特性并未得到有效的評價。為充分了解剁辣椒中乳酸菌的上述特性，本研究首先從12 份剁辣椒樣品中分離出乳酸菌，利用產酸、亞硝酸鹽降解率等指標篩選出優良的乳酸菌，對其進行鑒定，然后進行耐鹽、耐酸能力的比較，通過藥敏實驗初步考察分離乳酸菌的安全性。本研究將為剁辣椒發酵劑的開發利用提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養基與試劑

自然發酵剁辣椒為食品微生物實驗室自制。

MRS培養基：胰蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母浸粉5.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫-80 1.0 mL、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸錳0.25 g、瓊脂15.0 g、水1 L，pH 6.4；在MRS培養基中分別加入不同終含量的NaCl及NaNO2，用于菌株的特性研究。

藥敏片 杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DNP-9272BS-III生化培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；HH-8數顯恒溫水浴鍋 上海浦東物理光學儀器廠；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；TGL-20M離心機 長沙英泰儀器有限公司；雷磁pHs-3C pH計 上海精科實業有限公司；1510型全波長酶標儀 賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 剁辣椒中乳酸菌的分離、純化

稱取25 g自然發酵剁辣椒，放置于225 mL無菌生理鹽水中，搖勻，制備系列稀釋溶液，選取合適稀釋度的稀釋液，移取0.1 mL涂布于MRS固體平皿中，37 ℃培養24 h。挑取平板表面的單菌落至MRS平板上進行劃線純化，純化得到的單菌落進行保存。

1.3.2 菌株產酸分析

將純化后的單菌落接種于5 mL的MRS培養液中，37 ℃培養24 h，利用酶標儀檢測菌液在波長600 nm處的光密度值OD600nm，利用pH計測試各菌株發酵液的最終pH值。

1.3.3 菌株亞硝酸鹽降解率測定

將在MRS培養液中活化后的菌株，以2%接種量接種于含有150 μg/mL NaNO2的MRS培養液中，37℃培養24 h，測定培養前后培養液中NaNO2含量，計算培養液中亞硝酸鹽降解率。

1.3.4 亞硝酸鹽含量的測定

采用GB/T 5009.33—2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中鹽酸萘乙二胺分光光度法[7]。

1.3.5 篩選菌株的生理生化鑒定

生理生化實驗包括：產酸產氣實驗、精氨酸產氨實驗、淀粉水解實驗、明膠液化實驗、硫化氫實驗、碳源利用實驗等[8-9]。

1.3.6 分子生物學鑒定

乳酸菌基因組DNA的提?。喊凑仗旄萍加邢蓿ū本┯邢薰炯毦蚪MDNA提取試劑盒說明書進行。

16S rDNA的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增：PCR擴增引物分別為：正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物1541R：5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’。

引物的合成和PCR產物的測序由華大基因完成。PCR條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30次循環，最后72 ℃延伸10 min。測定后的16S rDNA序列登陸NCBI進行BLAST比對。

1.3.7 篩選菌株的生長曲線

將活化12 h后的菌液按1%的接種量轉接至MRS液體培養基中，同時以不接種的MRS液體培養基作為空白對照，于37 ℃恒溫培養，分別在2、4、6、8、10、12、24、36、48 h時將培養管取出，測定各菌株的OD600nm值，記錄測量結果。以培養時間為橫坐標，OD600nm值為縱坐標，繪制各菌株生長曲線。

1.3.8 篩選菌株的耐鹽能力比較

將初篩篩選出的乳桿菌活化后分別接種于含6%、9% NaCl的MRS培養液中，37 ℃培養，每隔2 h測定菌液OD600nm值。以培養時間為橫坐標，菌液OD600nm為縱坐標，繪制曲線。

1.3.9 篩選菌株的耐酸能力比較

將初篩篩選出的乳桿菌活化后分別接種于pH 3和pH 5的MRS培養液中，37 ℃培養，每隔2 h測定菌液OD600nm值。以培養時間為橫坐標，菌液OD600nm為縱坐標，繪制曲線。

1.3.10 藥敏實驗

采用紅霉素（15 μg/片）、四環素（40 μg/片）、慶大霉素（10 μg/片）、青霉素（10 μg/片）、氨芐西林 （10 μg/片）對篩選菌株進行藥敏實驗（紅霉素、氨芐西林、慶大霉素、四環素、青霉素）[10-11]。將活化后的篩選菌株以體積分數2%接種于MRS培養基中，37 ℃培養4～6 h（OD600nm=0.5），取0.1 mL涂布于MRS平板上，取抗生素藥片，輕輕置于MRS平板表面。平板置于37 ℃培養12 h，觀察抗生素藥片周圍是否出現抑菌圈。

1.4 數據統計分析

實驗數據的統計分析及數據繪圖，均采用Origin 8.0軟件。

2 結果與分析

2.1 分離菌株的產酸能力比較

通過鏡檢與過氧化氫酶實驗，共從12 份自然發酵剁辣椒中分離出28 株乳酸菌。通過比較28 株乳酸菌培養24 h發酵液的OD600nm值和pH值，比較不同菌株的生長能力和產酸能力，實驗結果如表1所示。

表1 不同菌株的OD600 nm值和pH值比較Table 1 Comparison of OD600 nm and pH values of cultures of 28 isolates

根據表1可知，分離的28 株乳酸菌，通過24 h的培養，OD600nm的范圍集中在0.37～1.68，最終pH值的范圍集中在4.01～5.56之間，其中W-2、W-4、Y-5、Y-12、Y-14、Y-17、Y-18、Y-25、Y-27、Y-28、Y-29、Y-31這12 株菌的OD600nm值在1.00以上，最終pH值在4.5以下，呈酸性，選擇這12 株菌進行亞硝酸鹽降解實驗。

2.2 亞硝酸鹽降解率比較

將初篩后的12 株菌接種至含NaNO2的MRS液體培養基中，37 ℃恒溫培養箱中培養24 h。亞硝酸鹽降解率結果見表2。

由表2可知，除了Y-14菌以外，其余復篩的11 株乳酸菌，對于150 mg/L NaNO2的亞硝酸鹽降解率都在90%以上，選擇降解率在96%以上的W-4、Y-5、Y-12、Y-25、Y-31這5 株菌進行鑒定。

表2 初篩菌株的復篩結果Table 2 Comparison of OD600 nm and pH values of 12 of the 28 isolates

2.3 分離菌株的鑒定

表3 分離菌株的發酵特性Table 3 Fermentation characteristics of 5 selected strains

參考《伯杰細菌手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》[12-13]，結合表3結果，初步鑒定分離菌株Y-5、Y-12、W-4與植物乳桿菌（L. plantarum）鑒定特征接近，分離菌株Y-25和Y-31與短乳桿菌（L. brevis）鑒定特征相接近。

分別提取Y-5、Y-12、Y-25、Y-31、W-4的基因組DNA后，用16S rDNA通用引物進行PCR擴增，擴增得到的片段大小在1.5 kb左右（圖1）。

將PCR產物進行測序，測序結果登錄NCBI網站，進行BLAST序列比對，發現Y-5、Y-12、W-4與植物乳桿菌的16S rDNA同源性達99%以上（圖2），結合生理生化實驗的結果，可判定Y-5、Y-12、W-4這3 株菌為植物乳桿菌。Y-25、Y-31的16S rDNA序列與短乳桿菌的同源性達99%以上，結合生理生化實驗結果，可以判定Y-25、Y-31為短乳桿菌。

圖1 16S rDNA擴增結果Fig. 1 PCR amplification of 16S rDNA

圖2 基于篩選菌株16S rDNA序列構建的系統發育樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences of isolated strains

2.4 乳桿菌的生長曲線

圖3 分離菌株的生長曲線Fig. 3 Growth curves of five isolated strains

將W-4、Y-5、Y-12、Y-25、Y-31這5 株菌活化后轉接至MRS液體培養基中，于37 ℃恒溫培養。由圖3可以看出，5 株菌的生長情況基本相似。在培養至約6 h時進入對數生長期，在15 h時進入平臺期。

2.5 乳桿菌耐鹽能力比較

將W-4、Y-5、Y-12、Y-25、Y-31這5 株菌活化后轉接至含鹽量分別為6%、9%的MRS液體培養基中，于37 ℃恒溫培養。

圖4 分離菌株在6% NaCl脅迫下的生長情況Fig. 4 Growth curves of five strains under osmotic stress with 6% NaCl

從圖4可以看出，在6% NaCl的滲透壓脅迫下，5 株菌的生長均出現不同程度的抑制。W-4、Y-5、Y-12這3 株植物乳桿菌，在培養3 h后相繼進入對數生長期，較圖3中生長曲線提早進入對數生長期，可能的原因是接種時所用的活化菌株不是處于同一生長階段，致使生長延遲期不一致，但滲透壓脅迫下的對數生長期細胞增長數量明顯低于正常狀態下生長數量。Y-25、Y-31這兩株短乳桿菌在前12 h內基本沒有生長，培養24 h后OD600nm值才達到0.8左右。

圖5 分離菌株在9% NaCl脅迫下的生長情況Fig. 5 Growth curves of five strains under osmotic stress with 9% NaCl

從圖5可看出，9% NaCl的滲透壓脅迫下，植物乳桿菌W-4在培養6 h后進入對數生長期，其他4株乳酸菌在培養的12 h內基本沒有生長，而短乳桿菌在培養24 h后OD600nm值基本沒有變化，說明短乳桿菌的生長受到強烈抑制。由此可見，植物乳桿菌相比較于短乳桿菌，具有更強的抗滲透壓脅迫能力，其中植物乳桿菌W-4的抗滲透壓能力最強。

2.6 乳桿菌耐酸能力比較

將W-4、Y-5、Y-12、Y-25、Y-31這5 株菌活化后分別轉接至pH 3和pH 5的MRS液體培養基中，于37 ℃恒溫培養。從圖6可以看出，在pH 5條件下，5 株菌的生長情況基本一樣，在培養至6 h時進入對數生長期，而在培養12 h時，W-4、Y-5、Y-31這3 株菌的OD600nm值已經高于另外兩株菌。在培養24 h后，5 株菌的OD600nm值基本接近，在1.5左右。

圖6 分離菌株在pH 5酸性脅迫下的生長情況Fig. 6 Growth curves of 5 strains under acidic stress with pH 5

而在pH 3條件下，5 株菌的生長受到明顯的抑制，沒有明顯的對數生長期，生長較為緩慢（圖7）。相比較其他菌株，植物乳桿菌W-4的生長受到的抑制作用最小。

圖7 分離菌株在pH 3酸性脅迫下的生長情況Fig. 7 Growth curves of 5 strains under acidic stress with pH 3

2.7 乳桿菌藥敏實驗結果

藥敏實驗證實W-4、Y-5、Y-12、Y-25、Y-31這5 株菌對測試的5 種抗生素均敏感，圖8為W-4藥敏實驗的結果，出現抑菌圈說明該菌株對測試的5 種抗生素敏感。

圖8 植物乳桿菌W-4對抗生素的敏感性Fig. 8 Antibiotic susceptibility of L. plantarum W-4

3 討 論

辣椒是世界上消費量最大的蔬菜之一，而且辣椒富含VC、多酚、黃酮、辣椒素等活性成分，因此具有很強的抗氧化能力[14-16]。剁辣椒品質的形成與乳酸菌的作用密不可分。本研究從自然發酵剁辣椒中分離出乳酸菌，利用產酸、亞硝酸鹽降解率等指標篩選出優良的乳酸菌，經生理生化與分子生物學鑒定，分離菌株為植物乳桿菌和短乳桿菌，這與前人的研究結果一致。

植物乳桿菌是一種適應能力較強的乳酸菌，在很多發酵食品中都有它的身影。如乳制品、發酵蔬菜、發酵肉制品等，而且植物乳桿菌在人和動物的腸道中也能進行定殖[17-18]。植物乳桿菌常見于發酵黃瓜、番茄、茄子等果蔬中[19-21]，其中有一些植物乳桿菌具有較強的亞硝酸鹽降解能力[22]。耐鹽能力對于植物乳桿菌在高鹽條件下進行發酵具有重要的意義，決定著植物乳桿菌能否快速成為發酵過程中的優勢菌[23-24]。本研究證實植物乳桿菌比短乳桿菌具有更強的耐脅迫能力，這與植物乳桿菌具有強大的環境適應能力有關，例如植物乳桿菌具有較多的植物多酚降解基因[25-26]，同時植物乳桿菌具有過氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶等合成能力，具有較強的抵御不良環境能力[27-28]。在蔬菜自然發酵過程中，主要利用蔬菜表面附著的乳酸菌啟動乳酸發酵的過程，這些來源于環境中乳酸菌的安全性也受到了關注，有研究報道指出泡菜原料表面多種乳酸菌對抗生素存在一定的抗性[29-30]。而植物乳桿菌是一致公認為安全的乳酸菌，國家衛生部明文規定可以添加在食品中，下一步工作將研究植物乳桿菌接種發酵剁辣椒的工藝，以及進一步闡明植物乳桿菌在剁辣椒品質形成中的作用機制。

參考文獻：

[1]CAGNO R D, CODA R, DE ANGELIS M, et al. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation[J]. Food Microbiology, 2013, 33(1): 1-10. DOI:10.1016/j.fm.2012.09.003.

[2]趙玲艷, 鄧放明, 楊撫林, 等. 自然發酵辣椒中乳酸菌的分離及其發酵性能研究[J]. 食品科學, 2005, 26(10): 82-86. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2005.10.014.

[3]鐘燕青. 自然發酵辣椒中乳酸菌分離篩選及香氣成分分析[D].長沙: 湖南農業大學, 2012.

[4]王蘭, 趙玲艷, 陳思思, 等. 發酵辣椒中產亞硝酸鹽還原酶短乳桿菌L5的選育及特性研究[J]. 中國釀造, 2014, 33(11): 25-29.DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.006.

[5]王麗芳, 王修俊, 鄭君花, 等. 發酵辣椒中一株乳酸菌的分離鑒定及其生長特性的研究[J]. 中國調味品, 2014, 39(6): 67-72.DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.2014.06.016.

[6]王修俊, 王麗芳, 鄭君花, 等. 貴州發酵辣椒中優良乳酸菌的分離鑒定及生長特性研究[J]. 食品科技, 2014, 39(10): 17-21.

[7]衛生部. 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定: GB/T 5009.33—2010[S].北京: 中國標準出版社, 2010: 4-9.

[8]東秀珠, 蔡妙瑛. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京: 科學出版社,2001.

[9]沈萍, 范秀容, 李廣武. 微生物學實驗[M]. 北京: 高等教育出版社, 1999.

[10]LIU G R, GRIFFITHS M W, WU P P, et al. Enterococcus faecium LM-2, a multi-bacteriocinogenic strain naturally occurring in “Byaslag”, a traditional cheese of Inner Mongolia in China[J]. Food Control, 2011,22(2): 283-289. DOI:10.1016/j.foodcont.2010.07.023.

[11]ZHOU H, HU Y M, JIANG L W, et al. Antilisterial activity of bacteriocin HY07 from Enterococcus faecium HY07 isolated from Chinese sausages[J]. Food Biotechnology, 2015, 29(1): 51-68.DOI:10.1080/08905436.2014.996893.

[12]BUCHANA R E, GIBBONS N E. 伯杰細菌鑒定手冊[M]. 8版.北京: 科學出版社, 1984: 797-815.

[13]凌代文. 乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M]. 北京: 中國輕工業出版社, 1999: 6-16.

[14]NAMIKI M. Antioxidants/antimutagenes in food[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1990, 29(4): 273-300.DOI:10.1080/10408399009527528.

[15]MATEOS R M, LEóN A M, SANDALIO L M, et al. Peroxisomes from peppers fruits (Capsicum annum L.): purification, characterization and antioxidant activity[J]. Journal of Plant Physiology, 2003, 160:1507-1516. DOI:10.1078/0176-1617-01008.

[16]DEEP A N, KAUR C, BINOY G, et al. Antioxidant constituents in some sweet pepper (Capsicum annum L.) genotypes during maturity[J]. LWT-Food Science and Technology, 2007, 40: 121-129.DOI:10.1016/j.lwt.2005.09.016.

[17]UPADRASTA A, STANTON C, HILL C, et al. Stress responses of lactic acid bacteria[M]. Springer US, 2011: 219-249.

[18]CHIBANNI-CHENNOUFI S, DILLMANN M L, MARVIN-GUY L,et al. Lactobacillus plantarum bacteriophage LP65: a new member of the SP01-like genus of the Family Myoviridae[J]. Journal of Bacteriology,2004, 186: 7069-7083. DOI:10.1128/JB.186.21.7069-7083.2004.

[19]DI CAGNO R, SURICO R F, MINERVINI G, et al. Use of autochthonous starters to ferment red and yellow peppers (Capsicum annum L.) to be stored at room temperature[J]. International Journal of Food Microbiology, 2009, 130: 108-116. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2009.01.019.

[20]SESE?A S, PALOP M L. An ecological study of lactic acid bacteria from Almagro eggplants fermentation brines[J]. Journal of Applied Microbiology,2007, 103: 1553-1561. DOI:10.1111/j.1365-2672.2007.03387.x.

[21]XIONG T, SONG S H, HUANG X H, et al. Screening and identification of functional Lactobacillus specific for vegetable fermentation[J]. Journal of Food Science, 2013, 78(1): M84-M89.DOI:10.1111/j.1750-3841.2012.03003.x.

[22]YAN P M, XUE W T, TAN S S, et al. Effect of inoculating lactic acid bacteria starter cultures on the nitrite concentration of fermenting Chinese paocai[J]. Food Control, 2008, 19: 50-55. DOI:10.1016/j.foodcont.2007.02.008.

[23]CHAMKHA M, SAYADI S, BRU V, et al. Microbiol diversity in Tunisian olive fermentation brine as evaluated by small subunit rRNA-single strand conformation polymorphism analysis[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 122: 211-215. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2007.11.052.

[24]MILESI M, Mc SWEENEY P, HYNES E. Viability and contribution to proteolysis of an adjunct culture of Lactobacillus plantarum in two model cheese systems: cheddar cheese-type and soft-cheese type[J].Journal of Applied Microbiology, 2008, 105: 884-892. DOI:10.1111/j.1365-2672.2008.03813.x.

[25]ESTEBAN-TORRES M, LANDETE J M, REVERóN I, et al. A Lactobacillus plantarum esterase active on a broad range of phenolic esters[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2015, 81(9):3235-3242. DOI:10.1128/AEM.00323-15.

[26]JIMéNEZ N, ESTEBAN-TORRES M, MANCHE?O J M, et al.Tannin degradation by a novel tannase enzyme present in some Lactobacillus plantarum strains[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(10): 2991-2997. DOI:10.1128/AEM.00324-14.

[27]BROOIJMANS R J W, VOS W M D, HUGENHOLTZ J. Lactobacillus plantarum WCFS1 electron transport chains[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(11): 3580-3585. DOI:10.1128/AEM.00147-09.

[28]WATANABE M, VEEN S V D, ABEE T. Impact of respiration on resistance of Lactobacillus plantarum WCFS1 to acid stress[J].Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(11): 4062-4064.DOI:10.1128/AEM.00287-12.

[29]蔡婷, 徐顧榕, 林凱, 等. 發酵用鮮辣椒中乳酸菌抗生素耐藥性與耐藥基因[J]. 食品與生物技術學報, 2016, 35(9): 941-949.DOI:10.3969/j.issn.1673-1689.2016.09.007.

[30]蔡婷, 盧倩文, 向文良, 等. 四川泡菜發酵原料-燈籠辣椒附生乳酸菌的抗生素耐藥性評估與耐藥基因分析[J]. 食品科學, 2017, 38(2):27-33. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702005.