刺參ACE抑制肽制備及降壓功效分析

華 鑫，孫樂常,2，萬楚君，唐 逸，翁 凌,2，劉光明,2，曹敏杰,2,*

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.水產品深加工技術國家地方聯合工程研究中心，福建 廈門 361021）

刺參（Stichopus japonicus）屬棘皮動物門（Echinodermata）、海參綱（Holothuroidea），是我國最重要的養殖品種。刺參不僅含有各種人體所需的氨基酸、維生素、必需脂肪酸還含有三萜苷[1]、腦苷脂[2]、多糖[3]和皂苷[4]等多種生物活性物質。體壁作為刺參的主要食用部位，主要是由膠原纖維、蛋白聚糖和其他成分組成[5]。干燥刺參體壁中蛋白質含量高達90%[6]，是典型的高蛋白、低脂肪、低膽固醇的優質食品。

另一方面，由高血壓所引起的心血管疾病發病率在我國仍居高不下，高血壓患者常伴有以下并發癥：腦出血、冠心病、腦梗塞等[7]。研究發現，血管緊張素轉化酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）是調節血壓的關鍵性蛋白酶。ACE是一種含鋅離子的二羧肽酶，可以將不具有活性的血管緊張素I轉化為強力血管收縮劑——血管緊張素II，同時鈍化舒緩激肽，從而使血壓升高[8]。一些通過化學合成法制備的降壓類藥物，如卡托普利、依那普利和賴諾普利，雖然具有良好的降壓功效，但同時會產生發熱、皮疹、咳嗽等藥物副作用[9]。因此，近年來人們將研究目標轉向更加安全的食源性ACE抑制肽。迄今為止，國內外已有很多文獻報道了利用水產動物蛋白制備ACE抑制肽。Lassoued等[10]利用堿性蛋白酶對棘背鰩魚魚皮明膠進行酶解，制備了高活性ACE抑制肽；Wu Qiang等[11]從鮑魚性腺酶解產物中純化得到1 個可抑制ACE活性的三肽；Balti等[12]從墨魚肌肉蛋白酶解產物中，分離得到了9 種新型ACE抑制肽。這些利用水產動物蛋白制備的小肽有望開發成為具有降血壓功效的功能性食品。

刺參肽是指以新鮮的刺參為原料，經過蛋白酶酶解，分離得到的具有一定功能特性的生物活性物質。研究發現，刺參蛋白肽具有良好的抗氧化活性[13]，能夠明顯升高大鼠血清高密度脂蛋白含量并降低血清甘油三酯的水平[14]，可以降低運動后小鼠的血尿素氮含量，提高其肝糖原含量，且抗疲勞功效隨灌胃量的提高而增強[15]。除此之外，它還具有抗腫瘤[16]、促進生殖細胞形成[17]等生物活性。本研究利用復合蛋白酶對刺參體壁進行酶解，并結合膜超濾技術對酶解產物進行分離，以期獲得高活性、低分子質量ACE抑制肽，旨在為刺參的深加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活刺參購自廈門高崎水產市場，去除內臟洗凈備用。

堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶、風味蛋白酶 丹麥Novozymes公司；卡托普利、Hip-His-Leu（HHL）、豬胰蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶美國Sigma公司；豬ACE、豬胃蛋白酶由本實驗室制備；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

PT-2100組織搗碎機 瑞士Kinematica公司；pH計德國Sartorius公司；恒溫水浴鍋 德國Memmert公司；Lambda 35紫外分光光度計 美國Perkin Elmer公司；膜超濾裝置 美國Millipore公司；FD-1D-50真空冷凍干燥機 北京博醫康科技公司；BP-98AL動物無創血壓測試系統 日本Softron公司。

1.3 方法

1.3.1 刺參ACE抑制肽的制備

1.3.1.1 蛋白酶的篩選

以新鮮刺參體壁作為酶解原料，分別用復合蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對原料進行酶解。固定酶解條件為料液比1∶8（g/mL）、加酶量1.0%（質量分數）、酶解時間5 h，在各酶的最適溫度和pH值下進行（表1）。酶解結束后于95 ℃加熱10 min終止反應，將酶解液進行離心（10 000×g，10 min），測定上清液的ACE抑制活性，篩選出酶解效果最佳的蛋白酶。

表1 5 種蛋白酶降解刺參的酶解條件Table 1 Hydrolysis conditions for sea cucumber by five proteinases

1.3.1.2 復合蛋白酶酶解條件的優化

選用復合蛋白酶作為刺參體壁水解蛋白酶，利用單因素試驗優化最佳酶解條件。1）料液比的影響：在加酶量1.0%、pH 6.5、酶解5 h條件下，考察料液比（1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10（g/mL））對刺參體壁酶解產物ACE抑制率的影響。2）加酶量的影響：在料液比1∶6（g/mL）、pH 6.5、酶解5 h條件下，考察復合蛋白酶添加量（0.1%、0.3%、0.5%、0.8%、1.0%、2.0%）對刺參體壁酶解產物ACE抑制率的影響。3）pH值的影響：在料液比1∶6（g/mL）、加酶量0.8%、酶解時間5 h條件下，考察反應pH值（6.0、6.5、7.0、8.0）對刺參體壁酶解產物ACE抑制率的影響。4）酶解時間的影響：在料液比1∶6（g/mL）、加酶量0.8%、pH 7.0條件下，考察酶解時間（0、2、4、6、8、10 h）對刺參體壁酶解產物ACE抑制率的影響。

1.3.2 ACE抑制率的測定

ACE抑制率的測定參照邱娟等[18]的方法并稍作修改，方法簡述如下：取濃度6.5 mmol/L的HHL溶液（含0.3 mol/L NaCl的硼酸鹽緩沖液，pH 8.3）50 μL與20 μL樣品混勻，37 ℃孵育5 min后加入20 μL ACE，37 ℃反應1 h后加入50 μL 1 mol/L HCl溶液終止反應。然后加入600 μL乙酸乙酯振蕩萃取，1 000×g離心5 min后吸取200 μL酯層，晾干后獲得萃取物，加入600 μL蒸餾水充分溶解該萃取物，在228 nm波長處測定其吸光度。對照組中樣品用硼酸鹽緩沖液代替，空白組則預先加入HCl終止反應。ACE抑制率計算如下所示：

式中：A樣為樣品組吸光度；A樣空為樣品空白組吸光度；A對為對照組吸光度；A對空為對照空白組吸光度。

IC50為樣品的ACE抑制率達到50%時所對應的蛋白質量濃度，其測定方法為：稱取一定質量樣品配制成不同質量濃度溶液，以樣品質量濃度為橫坐標，對ACE的抑制率為縱坐標繪制曲線，根據曲線計算IC50。

1.3.3 ACE抑制肽的分離及活性分析

刺參體壁酶解產物中多糖的去除，參照Forghani等[19]的方法并稍作修改，酶解液離心取上清液，然后向其中加入體積分數60%乙醇溶液，于4 ℃靜置24 h，離心（10 000×g，15 min），收集上清液，置于旋轉蒸發儀中旋轉蒸發去除酶解液中的乙醇。選取截留分子質量為3 kDa的超濾膜對樣品進行超濾，得到不同分子質量范圍的刺參肽（大于3 kDa和不大于3 kDa）。收集超濾外液（不大于3 kDa）用于性質分析。

1.3.4 刺參ACE抑制肽的穩定性分析

1.3.4.1 熱穩定性

將樣品溶液分別在60、70、80、90、100 ℃水浴中孵育2 h，冷卻至室溫后測定樣品的ACE抑制活性。

1.3.4.2 pH值穩定性

將樣品溶液的pH值分別調至2.0、4.0、6.0、8.0和10.0，37 ℃孵育2 h，待到達反應時間后，調節溶液pH值至中性測定其ACE抑制活性。

1.3.4.3 消化穩定性

模擬胃腸液消化實驗參照Liang Qiufang等[20]方法，略作修改。取5 mL樣品溶液調節其pH值至2.0，加入0.5%胃蛋白酶，37 ℃反應60 min，待到達反應時間后，立即用0.1 mol/L NaOH溶液調節溶液pH值至7.5，隨后加入0.5%胰蛋白酶和0.5%胰凝乳蛋白酶，37 ℃反應90 min，反應結束后于95 ℃水浴中放置10 min使酶失活，即得該樣品的胃腸液消化產物。

1.3.5 抑制動力學分析

抑制動力學實驗參照Barbana等[21]報道的方法，并稍作修改。將ACE與不同質量濃度（0、0.5、1.0、1.5、3.0 mg/mL）的刺參肽孵育，在不同HHL底物濃度下（0.5、1.0、2.5、6.5 mmol/L），測定ACE抑制活性，利用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法對刺參ACE抑制肽的抑制模式進行研究。

1.3.6 刺參ACE抑制肽的體內降血壓活性分析

選用北京維通利華實驗動物技術有限公司提供的9～11 周、尾部收縮壓超過180 mm Hg的雄性自發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat，SHR）。飼養于24 ℃恒溫12 h光照-12 h黑暗的房間，食物與水自由采食，適應性飼養1 周。SHR隨機分為4 組，每組4 只，以卡托普利作為陽性對照（10 mg/kg），刺參ACE抑制肽（小于3 kDa）通過口服灌胃的方式進行給藥，灌胃量為100 mg/kg和300 mg/kg，陰性對照組灌胃同等劑量生理鹽水。按照上述劑量一次性給藥，測定大鼠給藥后0、2、4、6、12、24 h的收縮壓，每只大鼠血壓值為測定4 次的平均值。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

圖1 5 種蛋白酶酶解刺參體壁蛋白的Tricine-SDS-PAGEFig. 1 Tricine-SDS-PAGE analysis of hydrolysates produced with five proteinases

圖2 不同蛋白酶酶解產物的ACE抑制率Fig. 2 ACE inhibitory activity of hydrolysates produced with different proteinases

以刺參體壁作為酶解原料，分別用復合蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對原料進行酶解，以N-三（羥甲基）甲基甘氨酸十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Tricine sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，Tricine SDSPAGE）分析及酶解產物ACE抑制活性為考察指標，篩選出最佳蛋白酶。小分子肽段更容易被機體消化吸收[12]。堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶雖然對刺參體壁具有一定的酶解效果，但酶解產物中仍存在較多大分子質量的蛋白，而風味蛋白酶和復合蛋白酶酶解產物的泳道下方未發現明顯的電泳條帶（圖1）。說明風味蛋白酶和復合蛋白酶可以將刺參體壁降解成分子質量更小的多肽，其中，復合蛋白酶酶解產物具有較高的ACE抑制活性，抑制率為76.2%（圖2）。因此，選用復合蛋白酶進行后續的酶解實驗。

2.2 復合蛋白酶單因素試驗結果

圖3 各因素對酶解產物ACE抑制活性的影響Fig. 3 Effects of various factors on the ACE inhibitory activity of enzymatic hydrolysates

選用復合蛋白酶對刺參體壁進行定向酶解，以ACE抑制率為考察指標，對其制備工藝參數進行單因素優化，探究料液比、加酶量、反應pH值和酶解時間對刺參體壁酶解產物ACE抑制率的影響。由圖3a可知，隨著溶劑用量的增加，酶解產物ACE抑制率逐漸增大，當料液比為1∶6時酶解液活性最高，故選擇料液比為1∶6。隨著加酶量的增大，酶解液ACE抑制率呈現先升高后逐漸平緩的趨勢（圖3b），當加酶量為0.8%時，酶解產物ACE抑制率為74.7%，繼續增大加酶量，酶解產物對ACE抑制活性沒有明顯增加，因此選擇0.8%作為最適加酶量。同時，綜合考慮ACE抑制活性和生產成本，最佳酶解時間6 h（圖3c），pH 7.0（圖3d）。

2.3 ACE抑制肽的分離及活性分析

圖4 刺參ACE抑制肽活性分析Fig. 4 ACE inhibitory activity of sea cucumber-derived peptides

為了排除多糖對ACE的影響，以60%乙醇溶液對酶解液進行沉淀，以去除刺參體壁中的多糖。酶解液醇沉后經離心，取上清液進行3 kDa膜超濾，比較膜內外組分的ACE抑制活性。同時，對刺參ACE抑制肽的活性IC50進行測定，結果如圖4所示。當ACE抑制肽質量濃度為0～1.5 mg/mL時，ACE抑制活性持續上升，抑制率接近60%。當質量濃度大于1.5 mg/mL時，隨著ACE抑制肽質量濃度的增加，ACE抑制率仍有上升，但增加幅度逐漸趨于平緩。經計算，刺參ACE抑制肽的IC50為1.3 mg/mL。張艷萍等[22]利用貽貝為原料降解獲得的酶解產物ACE抑制活性IC50為34.6 mg/mL；Bernardini等[23]制備的牛胸肉酶解產物在蛋白質質量濃度為1.48 mg/mL時ACE抑制率為40.6%；周麗杰等[24]采用酶解法和Plastein反應修飾法獲得牡蠣ACE抑制肽，在酶解液蛋白質質量濃度5 mg/mL時ACE抑制率為63.30%。以上結果表明，以刺參體壁為原料制備的ACE抑制肽具有較好的活性。此外，經3 kDa膜超濾，超濾外液具有較高的ACE抑制活性，IC50為0.8 mg/mL，而分子質量大于3 kDa組分IC50為3.2 mg/mL，說明分子質量較小的肽類其ACE抑制活性更高。

2.4 刺參ACE抑制肽的穩定性分析

圖5 溫度（a）、pH值（b）對刺參ACE抑制肽活性的影響Fig. 5 Effects of temperature and pH value on the activity of ACE inhibitory peptides

開發ACE抑制肽時，除需具有較高的ACE抑制活性外，還要在生產、貯藏及體內消化吸收過程中具有較強的穩定性，因此對刺參體壁ACE抑制肽的熱穩定性、pH值穩定性及消化穩定性進行了研究。

刺參多肽具有較好的熱穩定性（圖5a），其ACE抑制活性不隨溫度的升高而發生降低；從圖5b可以看出，刺參多肽同樣具有較強的pH值穩定性，經酸堿處理并沒有對其抑制活性產生明顯影響，這與已報道的墨魚ACE抑制肽的熱穩定性、pH值穩定性[12]基本一致。由于小分子肽段在高溫、酸性和堿性條件下不易發生肽鏈的斷裂[25]，復合蛋白酶可以將刺參體壁降解成小分子多肽，因此在高溫、酸性和堿性條件下刺參ACE抑制肽仍具有較強的ACE抑制活性。

表2 胃腸道蛋白酶消化對刺參ACE抑制肽活性的影響Table 2 Effects of gastrointestinal enzymatic digestion on the activity of ACE inhibitory peptides

從表2可以看出，刺參ACE抑制肽經胃腸液蛋白酶消化后，其活性未降低。這可能是由于：1）刺參ACE抑制肽具有較強的抵抗胃腸道蛋白酶消化的能力；2）胃腸道蛋白酶將刺參ACE抑制肽降解成了分子質量更小的刺參肽，而這些多肽同樣具有ACE抑制活性。該現象在油菜籽ACE抑制肽的體外消化實驗中也被發現[26]。

2.5 抑制動力學分析

利用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法對刺參ACE抑制肽的抑制模式進行研究。從圖6可以看出，當刺參ACE抑制肽的質量濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、3.0 mg/mL時，它們的Lineweaver-Burk雙倒數曲線相交于X軸，隨著刺參ACE抑制肽質量濃度的增加，Km未發生明顯變化，而最大速率Vmax逐漸降低，說明刺參ACE抑制肽能結合在ACE的非活性部位，且不影響底物與ACE催化區域的結合，并通過與酶-底物形成的三元復合物抑制其進行進一步分解而實現對ACE的抑制，屬于非競爭性抑制類型。這與報道的酵母ACE抑制肽[27]和扁豆蛋白ACE抑制肽[21]具有相同的抑制模式。

圖6 刺參ACE抑制肽對ACE抑制的動力學分析Fig. 6 Kinetic study of the inhibitory activity of sea cucumber-derived peptides against ACE

2.6 刺參ACE抑制肽對SHR血壓的影響

圖7 口服刺參ACE抑制肽對SHR收縮壓的影響Fig. 7 Changes in SBP of SHR after oral administration of sea cucumber-derived peptides

動物收縮壓是指動物心室收縮時血管內壁的壓力（亦稱高壓），是高血壓動物實驗常用的測定指標[28-29]。本研究中，以SHR為對象，一次性灌胃刺參ACE抑制肽，并在給藥后0、2、4、6、12、24 h測定大鼠尾動脈收縮壓，結果如圖7所示。灌胃前SHR的平均血壓為（189±0.83）mm Hg，灌胃后24 h內對照組大鼠血壓無顯著變化。刺參ACE抑制肽實驗組SHR在灌胃后，血壓均有所降低，且降幅隨著灌胃量的增加而增大。其中100 mg/kg實驗組的大鼠血壓降幅不明顯，而300 mg/kg實驗組對SHR表現出良好的降壓效果，灌胃后2 h，SHR的血壓顯著降低，在給藥后4 h 收縮壓降幅達到最高，為26 mm Hg，盡管與陽性對照卡托普利（10 mg/kg）的35 mm Hg存在一定的差距，但刺參肽是食源性ACE抑制肽，具有降壓效果溫和、安全性高、無藥物副作用等優點。給藥4 h后刺參ACE抑制肽實驗組及卡托普利組大鼠血壓逐漸回升，24 h后各組大鼠血壓與空白組無顯著差異（P＜0.05）。Gao Mingrong等[29]從星蟲中純化得到一種ACE抑制肽，以5 mg/kg劑量一次性灌胃SHR，發現SHR在灌胃后2 h出現明顯的收縮壓下降，且能在4 h內持續保持較低水平。相比之下，本研究所用的是酶解多肽組分，在得率上遠高于純化肽，具有更好的應用前景。實驗期間，SHR未出現咳嗽、過敏等不良反應。前期研究中以刺參性腺為原料分離了ACE抑制肽NAPHMR，其IC50為（260.22±3.71）μmol/L[30]。可見，刺參是制備ACE抑制肽的良好原料。

3 結 論

利用復合蛋白酶對刺參體壁進行酶解，通過單因素法優化獲得酶解的最佳工藝參數為：料液比1∶6（g/mL）、加酶量0.8%、酶解時間6 h、pH 7.0。酶解產物經膜超濾，分子質量小于3 kDa的組分具有較高ACE抑制活性，IC50為0.8 mg/mL，對ACE表現為非競爭性抑制。此外，刺參ACE抑制肽不僅具有較好的熱穩定性和pH值穩定性，同時具有較強的抵抗胃腸道蛋白酶消化的能力。口服刺參ACE抑制肽能夠顯著性降低SHR血壓，說明其在機體內具有良好的降壓功效，具有潛在的開發價值和應用前景。

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