Cu2＋對多粘類芽孢桿菌增殖及其轉化人參皂苷的影響

肖茹雪，臧 埔*，郜玉鋼*，趙 巖，祝洪艷，何忠梅，楊 鶴，劉雙利，張連學

（吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118）

人參內生多粘類芽孢桿菌中含有多種生物活性物質，包括固氮酶、植物激素、多糖、水解酶類、抗生素等[1-3]，在生物固氮、促進植物生長、研制新型抗生素、防治植物病害等方面具有重大應用價值[4-8]。隨著環境污染的日趨嚴重和人們對食品及健康安全要求的提高，微生物農藥受到越來越多的重視。本研究采用人參內生多粘類芽孢桿菌菌株是從人參植株中分離獲得的，該菌株的發酵液對人參黑斑病菌（Alternaria panax Whetz.）、人參銹腐菌（Cylindrocarpon destructans Zinns.）、人參菌核病菌（Sclerotinia schinseng Wang.）、人參立枯病菌（Rhizoctonia solani Kuhn.）、人參根腐病菌（Fusarium solani App.）及人參細菌性軟腐病（Erwinia carotovora subsp.）等病原菌具有明顯的防病效果[9]，表現了良好的生防前景，因此如何尋找一種低成本、高效快捷的多粘類芽孢桿菌及其制劑工業化放大培養方式已成為研究的熱點。

人參皂苷為人參主要藥效成分，但其含量較低，特別是稀有人參皂苷，主要是通過微生物產生的，如酶水解C20上的β-（1-6）-糖苷鍵以及C3上β-（1-2）-葡萄糖苷鍵，繼而生成Rd→F2或Rg3→C-K或Rh2→二醇型人參皂苷元[10]。20世紀70年代日本Koda等[11]發現用土壤菌的發酵液轉化人參皂苷可得到稀有皂苷C-K；90年代日本Yosioka等[12]發現經腸道微生物轉化后，人參皂苷Rb1、Rg1可形成易于人體吸收的苷元；2006年Su Jinhuan等[13]從土壤中分離出菌株Fusarium proliferatum ECU2042，該菌能水解人參皂苷Rg3成為Rh2，轉化率為60.3%。Yousef等[14]利用畸雌腐霉菌發酵轉化二醇類人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd等為F2。2007年，成樂琴等[15]從土壤中篩選到一株新細菌Microbacterium esteraromatium GS514，發酵產酶轉化Rb1為Rd、Rg3、F2及C-K。佟心等[16]對德式乳桿菌保加利亞亞種研究表明，其轉化人參總皂苷時可以得到人參稀有皂苷Rh2。2011年，楊元超等[17]利用串珠鐮孢菌Fuasarium moniliforme轉化三七莖葉總皂苷Rb1、Rd為C-K。Cu2＋通過與蛋白質或其他有機基團結合，形成了酶、激素等生物大分子，適量濃度的Cu2＋可促進微生物的生長[18]，可見Cu2＋可提高微生物的增殖。2013年本實驗室用多粘類芽孢桿菌轉化人參，提高了Rd等人參皂苷單體含量，人參皂苷的轉化離不開次生代謝途徑的關鍵酶催化，可見人參皂苷的轉化酶活性對皂苷轉化起主要作用[19-21]，Cu2＋是多種酶的活性中心，可能提高其轉化酶的活性[22]。因此本研究系統開展了Cu2＋對多粘類芽孢桿菌增殖及其轉化人參皂苷影響的研究，旨在為利用該菌株進行植物病害的生物防治生產無公害人參食品，并提高人參中人參皂苷含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人參（Panax ginseng C. A. Mey.），經吉林農業大學中藥材學院郜玉鋼教授鑒定為4 a生人參，產地為吉林省撫松縣；多粘類芽孢桿菌來自本實驗室，已保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC：No.7250。

人參皂苷對照品Rg1、Re、Rg2、Rg3、Rg5、Rf、F1、F2、Rc、Rd、Rb1、Rb2、Rb3、Rh2、compound K、20（R）-Rh1、Rk3、Rh4、原人參二醇及原人參三醇質量分數均在98%以上，批號分別為201511、201523、201545、201506、201524、201537、201549、201521、201536、201579、201501、201551、201518、201543、201520、201515、201562、201571、201519、201513，來自吉林大學天然藥物化學實驗室；葡萄糖、CuSO4·5H2O 北京化學工業集團有限責任公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國默克公司；純凈水杭州娃哈哈公司；其余試劑為分析純。

1.2 儀器與設備

CHA-S型氣浴往返恒溫振蕩培養箱 江蘇省金壇市大地自動化儀器廠；Tecan Infinite?200 Pro型多功能酶標儀 上海迪奧生物科技有限公司；LC-2010A高效液相色譜儀（配有LC-2010A型液相色譜泵、LC-2010A型自動進樣器、CLASS-VP色譜工作站）、AUY220電子分析天平 日本島津公司；KQ-250DV超聲波清洗器 昆山舒美超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Cu2＋對多粘類芽孢桿菌增殖的影響

無菌條件下，向每個滅菌試管中分別加入5 mL含Cu2＋質量濃度分別為0、10、30、50、100、500、1 000、5 000 mg/L的PDB培養基[23]，每個質量濃度處理設3 次重復，再向每個試管中分別接種0.05 mL活化的OD600nm值為0.5的多粘類芽孢桿菌菌液，置于28 ℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養。分別于0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h取樣測定OD600nm值。

1.3.2 Cu2＋對多粘類芽孢桿菌轉化人參皂苷的影響

準確稱取過20目人參粉末10.0 g于100 mL玻璃三角瓶中，置于烘箱80 ℃干熱滅菌2 h，冷卻后，無菌條件下，再向玻璃三角瓶中加入滅菌的含Cu2＋質量濃度為10～5 000 mg/L的PDB培養基30 mL，再接種OD600nm為0.5的人參內生多粘類芽孢桿菌菌液0.03 mL，轉速為120 r/min振蕩培養，培養溫度為28 ℃，培養時間為7 d，室溫真空干燥，得人參內生多粘類芽孢桿菌轉化產物，4 ℃貯存備用。精確稱取各待測樣品0.5 g于10 mL離心管中，分別加入5.0 mL色譜甲醇溶液，密封，超聲提取45 min，靜置過夜，再超聲45 min，離心，取上清液，用0.45 μm濾膜濾過，備用。色譜條件參照本實驗室建立的同時測定20種人參皂苷含量的方法[24]。

1.4 統計分析

所得數據應用SPSS 23.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 Cu2＋對多粘類芽孢桿菌增殖的影響

圖1 不同質量濃度Cu2＋培養條件下多粘類芽孢桿菌的生長曲線Fig. 1 Growth curve of Paenibacillus polymyxa at different Cu2+ concentrations

由圖1可見，在本實驗設計范圍內，當Cu2＋質量濃度為10、30、50 mg/L時，與對照組相比多粘類芽孢桿菌增殖的延遲期縮短，對數期提前；當Cu2＋質量濃度為30 mg/L時，延遲期縮短12 h左右，對數期提前24 h左右；適宜質量濃度的Cu2＋對多粘類芽孢桿菌增殖有一定的促進作用，其中Cu2＋質量濃度為30 mg/L時，對多粘類芽孢桿菌促進作用最強。但當Cu2＋質量濃度大于100 mg/L時，對多粘類芽孢桿菌增殖有一定的抑制作用，隨著質量濃度的增加抑制作用增強。

2.2 Cu2＋對多粘類芽孢桿菌轉化人參皂苷的影響

2.2.1 色譜峰歸屬

圖2 混標及樣品高效液相色譜圖Fig. 2 HPLC profiles of mixed reference solution and samples

對照品與樣品色譜圖見圖2。20種人參皂苷單體均得到良好分離。

2.2.2 線性關系考察結果

表1 人參皂苷單體回歸方程Table 1 Regression equations with correlation coefficients for ginsenosides

以進樣中人參皂苷質量（Y）對峰面積積分值（X）作圖，得到線性回歸方程，見表1。20 種人參皂苷單體Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rh1、Rb2、Rb3、F1、Rd、Rk3、F2、Rh4、Rg3、原人參三醇、Compound K、Rg5、Rh2、原人參二醇在0.5～40 μg范圍內呈良好的線性關系（r＞0.999，n=6）。

2.2.3 Cu2＋對多粘類芽孢桿菌轉化人參皂苷含量的影響

如表2所示，轉化體系中Cu2＋質量濃度為10 mg/L時，人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb3、Rd、原人參三醇、Compound K、原人參二醇同對照組相比含量顯著增加（P＜0.05）；轉化體系中Cu2＋離子質量濃度為30 mg/L時，轉化產物中15 種人參皂苷單體Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rb2、Rb3、Rd、Rg3、原人參三醇、Compound K、Rg5、Rh2、原人參二醇含量均顯著增加（P＜0.05）；轉化體系中Cu2＋質量濃度為50 mg/L時，人參皂苷Rg1、Rf、Rb1、Rb2、Rb3、Rd、原人參三醇、Compound K、Rh2含量顯著高于對照組（P＜0.05）。但是，轉化體系中Cu2＋質量濃度100 mg/L時，Rg1、Rb1、Rb2及20 種人參皂苷加和值均低于對照組（P＜0.05）；轉化體系中Cu2＋質量濃度500 mg/L時，Rg1、Rf、Rb2及20種人參皂苷加和值均低于對照組（P＜0.05）；轉化體系中Cu2＋質量濃度為2 500 mg/L時，Rg1、Rf、Rb1、Rg2、Rb2、Compound K及20 種人參皂苷加和值均低于對照組（P＜0.05）；轉化體系中Cu2＋質量濃度5 000 mg/L時，Rg1、Re、Rf 、Rb1、Rg2、Rb2、Rh4、Rg3及20種人參皂苷加和值均低于對照組（P＜0.05）。綜上可見，轉化體系中Cu2＋質量濃度為10～50 mg/L時，促進多粘類芽孢桿菌轉化人參皂苷，轉化體系中Cu2＋質量濃度為30 mg/L時，多粘類芽孢桿菌轉化人參皂苷能力最強；但轉化體系中Cu2＋質量濃度超過100 mg/L，Cu2＋反而抑制多粘類芽孢桿菌轉化人參皂苷，并且隨Cu2＋質量濃度增大而抑制作用增強。

3 討 論

多粘類芽孢桿菌作為美國食品藥品監督管理局批準的可用于食品的益生菌，也是我國免于安檢的菌株，該菌表現了良好的生防前景，對于降低食品原料的農藥殘留有重要意義，因此其應用及開發逐年增多[25-27]。如何高效培養多粘類芽孢桿菌已成為研究的熱點。本研究發現Cu2＋質量濃度為10、30、50 mg/L時，可以相對縮短其延遲期，促進菌體對數期繁殖速度并提高其增殖數量，Cu2＋質量濃度為30 mg/L時，效果最好；但Cu2＋質量濃度超過100 mg/L時，對菌株增殖有明顯的抑制作用。本研究證明適宜質量濃度的Cu2＋有利于多粘類芽孢桿菌增殖，對用該菌株進行植物病害的生物防治，從而生產無公害人參食品有一定的參考價值。在多粘類芽孢桿菌實際生產中要考慮微量元素適宜質量濃度范圍，研究表明微量元素對菌株的增殖有顯著影響，與其他文獻報道的結果相一致[28-31]。

本實驗室已證明多粘類芽孢桿菌可顯著提高人參皂苷含量[18-20]，但鮮見用 Cu2＋促進多粘類芽孢桿菌轉化人參皂苷的方法報道，也鮮見Cu2＋促進多粘類芽孢桿菌轉化人參皂苷適宜質量濃度的報道。本研究證明Cu2＋質量濃度為10～50 mg/L時，可促進多粘類芽孢桿菌轉化人參皂苷，轉化體系中Cu2＋質量濃度為30 mg/L時，多粘類芽孢桿菌轉化人參皂苷能力最強，總皂苷加和值為對照組1.64 倍，為微生物轉化稀有人參皂苷或提高其產量提供了理論參考。但轉化體系中Cu2＋質量濃度超過100 mg/L，Cu2＋反而抑制多粘類芽孢桿菌轉化人參皂苷，并且隨Cu2＋質量濃度增大而抑制作用增強。分析認為這是由于適宜質量濃度的Cu2＋促進多粘類芽孢桿菌對脂肪酸等營養物質的吸收，從而促進其增殖[32]，而過高質量濃度的Cu2＋，反而與巰基結合，破壞細胞合成酶的活性使細胞喪失分裂增殖的能力[33]；適宜質量濃度的Cu2＋提高了多粘類芽孢桿菌的數量及糖基轉移酶的活性，從而促進了多粘類芽孢桿菌對人參皂苷轉化，其作用機制有待于進一步研究[34]。

參考文獻：

[1]劉振華, 井長勤, 周晨妍. 生防細菌多粘類芽孢桿菌多糖研究進展[J]. 上海農業學報, 2015(4): 146-150. DOI:10.15955/j.issnlooo-3924.2015.04.29.

[2]蒼桂璐, 張付云, 楊陽, 等. 多粘類芽孢桿菌的研究進展[J]. 安徽農業科學,2013, 41(2): 487-489. DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2013.02.105.

[3]王劉慶, 王秋影, 廖美德. 多粘類芽孢桿菌生物特性及其機理研究進展[J]. 中國農學通報, 2013(11): 158-163. DOI:10.3969/j.issn.1000-6850.2013.11.031.

[4]?AKMAK?I R, KANTAR F, ALGUR ? F. Sugar beet and barley yields in relation to Bacillus polymyxa and Bacillus megaterium var.phosphaticum inoculation[J]. Journal of Plant Nutrition & Soil Science,2015, 162(4): 437-442. DOI:10.1002/(SICI)1522-2624(199908)1622:4＜437::AID-JPLN437＞3.0.CO.

[5]KAVITHA S, SENTHILKUMAR S, GNANAMANICKAM S, et al. Isolation and partial characterization of antifungal protein from Bacillus polymyxa, strain VLB16[J]. Process Biochemistry, 2005,40(10): 3236-3243. DOI:10.1016/j.procbio.2005.03.060.

[6]GAO Y, LIU Q, ZANG P, et al. An endophytic bacterium isolated from Panax ginseng C.A. Meyer enhances growth, reduces morbidity, and stimulates ginsenoside biosynthesis[J]. Phytochemistry Letters, 2015,11: 132-138. DOI:10.1016/j.phytol.2014.12.007.

[7]徐桑爾, 盧鵬, 金莉萍, 等. 多粘類芽孢桿菌防治鐵皮石斛細菌性葉斑病及促生效果[J]. 浙江農業科學, 2016, 57(12): 2033-2034.DOI:10.16178/j.issn.0528-9017.20161233.

[8]扈進冬, 吳遠征, 李紀順, 等. 拮抗性多粘類芽孢桿菌PB-2及其制劑對葡萄霜霉病的防效測定[J]. 山東科學, 2014, 27(3): 30-33.DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2014.03.006.

[9]郜玉鋼, 張連學, 臧埔, 等. 一種人參內生多粘類芽孢桿菌生物防治菌劑制備方法: CN103250741A[P/OL]. 2013-08-21[2017-04-24].http://dbpub.cnki.net/grid2008/dbpub/detail.aspx?dbcode=SCPD&dbn ame=SCPD2013&filename=CN103250741A.

[10]郜玉鋼, 張連學, 臧埔, 等. 一種人參內生多粘類芽孢桿菌轉化人參皂苷的方法: CN103255193A[P/OL]. 2013-08-21[2017-04-24]. http://dbpub.cnki.net/grid2008/dbpub/detail.aspx?dbcode=SCPD&dbname=SCPD2013&filename=CN103255193A&uid.

[11]KODA H, TANAKA O. Enzymic hydrolysis of ginseng saponins and their related glycosides[J]. Yakugaku Zasshi, 1975, 95(2): 246.DOI:10.1248/yakushi1947.95.2_246.

[12]YOSIOKA I, SUGAWARA T, IMAI K, et al. Soil bacterial hydrolysis leading to genuine aglycone. V. on ginsenosides-Rb_1, Rb_2, and Rc of the ginseng root saponins[J]. Chemical & Pharmaceutical Bulletin,2008, 20(11): 2418-2421. DOI:10.1248/cpb.20.2418.

[13]SU J H, XU J H, LU W Y, et al. Enzymatic transformation of ginsenoside Rg 3, to Rh 2, using newly isolated Fusarium proliferatum ECU2042[J]. Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic, 2006,38(2): 113-118. DOI:10.1016/j.molcatb.2005.12.004.

[14]YOUSEF L F, BERNARDS M A. In vitro metabolism of ginsenosides by the ginseng root pathogen Pythium irregulare[J]. Phytochemistry,2006, 67(16): 1740-1749. DOI:10.1016/j.phytochem.2005.06.030.

[15]成樂琴, 金瑜真, 梁德春. 微生物酶催化制備人參皂苷20(S)-Rg2,20(S)-Rh1和20(S)-PPT[J]. 高等學校化學學報, 2011, 32(1): 67-73.

[16]佟心, 陳凱千. 一種人參皂苷Rh2的制備方法: CN102154428A[P/OL].2011-08-17[2017-04-24]. http://dbpub.cnki.net/grid2008/dbpub/detail.aspx?d bcode=SCPD&dbname=SCPD2011&filename=CN102154428A&uid.

[17]楊元超, 王英平, 閆梅霞, 等. 人參皂苷compound K轉化菌株的篩選[J]. 中國中藥雜志, 2011, 36(12): 1596-1598. DOI:10.4268/cjcmm20111210.

[18]陳琳. Cu、Cd對農業廢棄物發酵過程中微生物和酶活性的影響[D].楊凌: 西北農林科技大學, 2012: 18-24.

[19]李學. 內生細菌轉化人參皂苷的研究[D]. 長春: 吉林農業大學,2013: 33-40.

[20]姬慶. 多粘類芽孢桿菌轉化人參產物抗腫瘤活性及其機理初探[D].長春: 吉林農業大學, 2016: 35-39.

[21]JI Q, GAO Y, ZHAO Y, et al. Determination of ginsenosides by Bacillus polymyxa, conversion and evaluation on pharmacological activities of the conversion products[J]. Process Biochemistry, 2015,50(6): 1016-1022. DOI:10.1016/j.procbio.2015.03.013.

[22]林紅梅. 生態因子對人參皂苷含量及其生物合成關鍵酶基因表達的影響[D]. 長春: 吉林農業大學, 2016: 51-73.

[23]費鏞. 常用培養基的配制[J]. 食品工業科技, 1986, 7(4): 48-54.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.1986.04.012.

[24]楊艷文, 孟凡雙, 郜玉鋼, 等. 高效液相色譜法同時測定人參制劑中20種人參皂苷方法的建立[J]. 食品科學, 2016, 37(22): 131-135.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622019.

[25]徐匆, 馬錁, 李艷芳, 等. 多粘類芽孢桿菌復合生物保鮮劑對桂味荔枝的保鮮效果[J]. 廣東農業科學, 2016(7): 105-109. DOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2016.07.017.

[26]SHINTU P V, JAYARAM K M. Phosphate solubilising bacteria(Bacillus polymyxa): an effective approach to mitigate drought in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.)[J]. Tropical Plant Research,2015, 2(1): 17-22.

[27]羅遠嬋, 李淑蘭, 劉盼西, 等. 防治植物細菌性和真菌性土傳病害及葉部病害的新型、高效微生物殺菌劑—多粘類芽孢桿菌和海洋芽孢桿菌系列產品的創制及產業化[C]//中國植物保護學會2015年學術年會論文集, 2015: 3.

[28]王瑤, 劉玉香, 安華, 等. 金屬離子對糞產堿桿菌C16的脫氮和亞硝酸鹽積累的影響[J]. 微生物學通報, 2014, 41(11): 2254-2263.DOI:10.13344/j.microbiol.china.140122.

[29]孫淑靜, 單書凱, 李釗鋒, 等. 不同微量元素對斑玉蕈菌絲生長及酶活的影響[J]. 福建農林大學學報(自然科學版), 2015, 44(6): 639-645.DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.06.014.

[30]HE Y, CHEN Z, LIU X, et al. Influence of trace elements mixture on bacterial diversity and fermentation characteristics of liquid diet fermented with probiotics under air-tight condition[J]. PLoS ONE,2014, 9(12): e114218. DOI:10.1371/journal.pone.0114218.

[31]MAHMOOD M. Trace elements for growth and bulbiformin production by Bacillus subtilis[J]. Journal of Applied Bacteriology,2010, 35: 1-5. DOI:10.1111/j.1365-2672.1972.tb03668.x.

[32]宋秋瑾. 區域尺度下農田土壤微生物對重金屬和土壤特性的響應與定向變異[D]. 杭州: 浙江大學, 2015: 59-68.

[33]張志軍. 銅配合物抑菌作用的研究及幾種化學修飾電極的制備[D].武漢: 武漢理工大學, 2012: 43-51.

[34]陳欣, 薛軼, 劉吉華, 等. 人參毛狀根糖基轉移酶的分離純化及酶學性質研究[J]. 藥物生物技術, 2009(1): 50-54.