響應面法優化酶解藜麥糠蛋白制備抗氧化肽工藝

田旭靜，段鵬慧，范三紅,*，張婧婷

（1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.山西林業職業技術學院，山西 太原 030009）

自由基是機體在正常代謝過程中產生的有害化合物，具有高度氧化性。體內過多的自由基會引起蛋白質損傷、脂質過氧化、核酸損傷，人體亞細胞水平上的氧化誘發一些疾病的發生，如高血壓、肝硬化、糖尿病、老年癡呆癥和癌癥等[1-3]。抗氧化肽是能有效清除體內活性氧自由基的一種生物活性肽。它具有分子質量小、穩定性高、活性強和易吸收等特點[3]。抗氧化肽通過清除體內過剩的自由基、抑制脂質過氧化反應、鰲合金屬離子、提供氫質子[4]等實現抗氧化目的，從而保護線粒體和細胞結構，維持其正常功能。多肽抗氧化性的強弱可以通過還原能力和體外清除自由基能力的大小來表示。目前一些化學合成的抗氧化劑對人體存在一定的毒副作用，危害人體健康，因此安全健康高效的天然抗氧化劑的開發成為研究熱點[5-6]。運用酶解法可以使抗氧化活性肽從蛋白質中釋放出來，此方法得到的多肽抗氧化活性強，安全無毒，在醫學、化妝品、功能食品和食品配料等方面有廣闊的研究前景[7]。

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）為原產于南美洲的藜科（Chenopodiaceae）假谷物，是一種一年生草本植物，從20世紀80年代開始，我國引入藜麥，近幾年呈現規模化種植[8]。藜麥含有豐富的易被人體吸收的優質蛋白質，并且其氨基酸比例平衡，能夠滿足人體基本營養需求[9-11]。藜麥糠作為藜麥加工后的副產品，其蛋白質含量較高，一般都被簡單處理后作為動物飼料，造成資源浪費，沒有得到有效利用[12]。酶解藜麥糠蛋白可以得到具有一定功能的抗氧化肽，同時提高了藜麥糠的附加值，實現進一步綜合利用[13]。

本研究以藜麥糠蛋白為原料，以還原能力為控制指標，篩選出適合藜麥糠酶解的蛋白酶，通過單因素試驗和響應面分析優化了藜麥糠蛋白酶解的最佳工藝條件，并對藜麥糠抗氧化肽的自由基清除能力進行研究，為實現藜麥糠產品的深加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥糠蛋白（總蛋白質量分數87.3%）由實驗室自制。

中性蛋白酶（酶活力6.0×104U/g）、胰蛋白酶（酶活力2.5×105U/g）、堿性蛋白酶（酶活力2.0×105U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力6.0×106U/g）、風味蛋白酶（酶活力2.0×104U/g）、復合蛋白酶（酶活力1.0×105U/g）北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鹽酸、鐵氰化鉀、甲醛、三氯化鐵、三氯乙酸等均為分析純。

1.2 儀器與設備

AL204電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-W恒溫水浴箱 恒豐儀器制造有限公司；PHS-3C精密pH計 上海雷磁儀器廠；SP-200OUV型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；TDL-5離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 藜麥糠抗氧化肽制備工藝流程

質量分數5%的蛋白液→沸水浴10 min→不同酶解條件→沸水浴滅酶15 min→冷卻→離心（4 000 r/min，10 min）→收集上清液（測定還原能力和水解度）→貯藏備用

1.3.2 水解度的測定

總氮的測定采用凱氏定氮法[14]。游離氨基氮測定采用甲醛滴定法[15]。水解度計算如下式所示：

1.3.3 抗氧化活性的測定

1.3.3.1 還原能力的測定

取0.1 mL藜麥糠酶解液加入試管中，將0.2 mol/L PBS溶液（pH 6.6）和2%的鐵氰化鉀溶液各加入2.5 mL，在50 ℃水浴中反應20 min，再加2.5 mL 10%的三氯乙酸，搖勻后，5 000 r/min離心10 min。吸取2.5 mL上清液于試管中，將0.5 mL 0.1%三氯化鐵和2.5 mL蒸餾水依次加入其中，放置10 min后，樣品在700 nm波長處進行吸光度的測定。以樣品的吸光度表示其抗氧化肽的還原能力，吸光度變大，還原能力增強[16]。

1.3.3.2 自由基清除能力測定

羥自由基清除率測定采用水楊酸法[17]；超氧陰離子自由基清除率測定采用鄰苯三酚自氧化法[18]。

1.3.4 最佳蛋白酶的選擇

蛋白酶的初選：選擇6種蛋白酶（包括胰蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和復合蛋白酶）分別對藜麥糠蛋白進行初步水解。水解條件為加酶量2 000 U/g、底物質量濃度5 g/100 mL，在不同蛋白酶各自最適pH值和溫度條件下（表1），酶解時間為2 h，以水解度和還原能力為評價指標，綜合篩選出具有還原能力且水解度相對較高的蛋白酶，進行下一步實驗。

蛋白酶的復選：準確稱取5 g藜麥糠蛋白，用95 mL蒸餾水溶解配成5 g/100 mL質量濃度的蛋白液，單酶及復合酶（各復合酶比例為1∶1）加酶量均為2 000 U/g，在各酶最適pH值和溫度條件下（表1），酶解2 h，通過比較還原能力大小，篩選出最佳的單酶或復合酶。

1.3.5 酶解單因素試驗

固定底物質量濃度5 g/100 mL、加酶量4 000 U/g、酶解時間2 h、pH 7.5、酶解溫度50 ℃為單因素試驗條件，以還原能力和水解度為復合酶的測定指標，進一步考察加酶量（1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/g），酶解時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h），pH值（5.5、6.5、7.5、8.5、9.5），酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）對酶解效果的影響。

1.3.6 響應面試驗

根據單因素試驗結果，以pH值、加酶量、酶解溫度和酶解時間4 個因素為自變量，還原能力為響應值，采用響應面法設計4因素3水平試驗進行優化，按照Box-Behnken原理進行試驗設計[19-20]，試驗因素及水平見表2。

表2 藜麥糠蛋白酶解工藝優化響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and their coded values used in response surface analysis

2 結果與分析

2.1 最佳復合酶的確定

2.1.1 蛋白酶的初選

表3 不同種類蛋白酶作用下抗氧化肽的評價指標Table 3 Effect of different proteases on reducing powder and degree of hydrolysis

由表3可知，木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶相對于其他3 種酶水解度和還原能力均偏低，所以綜合考慮兩方面因素，選擇胰蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶進行下一步復選實驗。

2.1.2 蛋白酶的復選

比較各個單酶及復合酶的還原能力，由圖1可知，當風味蛋白酶與堿性蛋白酶以1∶1比例組合時，吸光度最大，為0.833，即還原能力最強。而其他組合酶與單酶加入時，還原能力降低，所以選取風味酶和堿性酶1∶1比例組成的復合酶來酶解藜麥糠蛋白效果最佳。

圖1 不同蛋白酶對藜麥糠酶解液還原能力的影響Fig. 1 Effects of different protease combinations on reducing power

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 加酶量對酶解效果的影響

在底物質量濃度為5 g/100 mL時，選定復合酶在pH 7.5和50 ℃條件下酶解2 h，考察不同加酶量對酶解液還原能力和水解度的影響，如圖2所示。

圖2 加酶量對酶解液還原能力和水解度的影響Fig. 2 Effects of enzyme dosage on reducing power and degree of hydrolysis

由圖2可知，隨著加酶量的增大，酶解液的還原能力和水解度逐漸上升，這是因為在底物質量濃度一定時，增大加酶量，使得酶與蛋白質分子接觸機會增多[21]，底物蛋白水解越充分，生成的小肽量越多，水解度和酶解多肽還原能力自然隨之上升。當加酶量繼續增至3 000 U/g時，逐漸表現出底物不足的現象，水解度的增加開始變得緩慢，但大分子的多肽還可以被進一步降解成具有抗氧化活性的小分子多肽，所以還原能力繼續上升。當加酶量增至4 000 U/g時，吸光度達到最大值0.528，此時還原能力最強。隨著加酶量進一步增加，就會出現小分子的抗氧化肽被降解，其還原能力開始下降[12]。因此，加酶量在4 000 U/g左右為最佳[22]。

2.2.2 pH值對酶解效果的影響

在底物質量濃度為5 g/100 mL時，選定復合酶在加酶量4 000 U/g和50 ℃條件下酶解2 h，考察pH值對酶解液還原能力和水解度的影響，如圖3所示。

圖3 pH值對酶解液還原能力和水解度的影響Fig. 3 Effect of pH on reducing power and degree of hydrolysis

pH值的改變，即改變溶液中H+離子濃度不僅會影響蛋白酶活性中心相關基團的解離狀態，也影響底物和輔酶的解離程度，進而影響酶解反應[22]。由圖3可知，在pH 5.5～7.5之間還原能力和水解度不斷增加，到7.5時均達到最大，之后逐漸降低，由于過酸或過堿會破壞酶的空間結構，使酶活力減弱甚至失活，pH值在適宜范圍內才可以發揮較佳的酶解效果。因此選定復合酶的最佳pH 7.5，在此條件下酶解能夠順利進行[23]。

2.2.3 酶解時間對酶解效果的影響

在底物質量濃度為5 g/100 mL時，選定復合酶在加酶量4 000 U/g和pH 7.5條件下酶解，溫度為50 ℃，考察酶解時間對酶解液還原能力和水解度的影響，如圖4所示。

圖4 酶解時間對酶解液還原能力和水解度的影響Fig. 4 Effect of hydrolysis time on reducing power and degree of hydrolysis

在酶解開始的一段時間，酶解液的還原能力和水解度逐漸升高，當酶解時間達到2.0 h時，還原能力最大值為0.533，之后有所降低。呈現一種先升高后下降的趨勢。而水解度在2.0 h后增加變得緩慢。出現這種趨勢可能因為酶解剛開始，底物和酶質量濃度均比較高，兩分子接觸面積較大，酶解速度較快，因此水解度增加幅度較大，同時迅速水解釋放出一些具有還原性的肽端[24]。表現為水解度和還原能力都升高。隨著反應進行，酶量減少，酶活力下降，酶解液中游離肽的不斷積累增加了對產物的抑制，水解度的增加趨勢逐漸平緩[25]。而一部分具有抗氧化性的肽端被水解成更小的片段，甚至過度水解，使酶解液中游離的氨基酸含量增加，酶解液的還原能力大幅度降低[24]。因此，選取酶解時間為2.0 h左右為宜。

2.2.4 酶解溫度對酶解效果的影響

在底物質量濃度為5 g/100 mL時，選定復合酶在加酶量4 000 U/g和pH 7.5條件下酶解2 h，考察酶解溫度對酶解液還原能力和水解度的影響，如圖5所示。

圖5 酶解溫度對酶解液還原能力和水解度的影響Fig. 5 Effects of hydrolysis temperature on reducing power and degree of hydrolysis

由圖5可以看出，酶解溫度在50 ℃以內，反應溫度上升，酶活性增加，同時酶解速度加快，水解度增加的同時，還原能力也升高，在50 ℃時，水解度最高達到13.81%，還原能力也達到最高。溫度超過50 ℃，可能會改變酶的空間結構，蛋白酶逐漸變性而喪失催化活性。水解度和還原能力均降低，因此，復合酶最佳酶解溫度應在50 ℃左右[26]。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗設計及結果

表4 響應面試驗設計及結果Table 4 Response surface design with experimental results

響應面試驗結果見表4，采用Design-Expert 8.0.6軟件對表4試驗數據進行方差分析，結果見表5。

表5 回歸方程方差分析Table 5 Analysis of variance of regression equation

通過響應面方差分析得到藜麥糠抗氧化肽還原能力的二次多項回歸方程為：Y=0.63－0.011A＋9.167×10－4B＋0.023C＋6.167×10－3D－6.750×10－3AB－1.500×10－3AC＋7.500×10－4AD＋0.014BC＋4.500×10－3BD＋5.250×10－3CD－0.014A2－0.024B2－0.051C2－0.037D2。

從表5可看出，模型P值小于0.000 1，表示該回歸模型高度顯著；失擬項P值為0.764 5，不顯著，說明該回歸模型預測值與實測值有較好的擬合水平，所選模型適宜。回歸系數R2為0.995 2，表明該模型相關度好[13]。值為0.990 3，表明有99.03%的響應值變化可以用模型來解釋，模型具有良好的擬合度，試驗誤差較小，可以對試驗結果進行準確分析和預測[27]。回歸方程各項的方差分析表明，A、C、D、AB、BC、CD、A2、B2、C2、D2均達到極顯著水平。回歸方程一次項系數絕對值的大小，決定了各因素對響應值影響的主次順序為酶解時間、加酶量、酶解溫度、pH值[28]。

2.3.2 響應面分析與條件優化

圖6 各因素交互作用對藜麥糠酶解液還原能力影響的響應面和等高線圖Fig. 6 Three-dimensional response surface and contour plots showing the interactive effects of hydrolysis conditions on reducing power

由圖6a可知，酶解溫度50 ℃，酶解時間2 h，當加酶量較少時，還原能力隨pH值的升高先急劇升高后緩慢下降，當加酶量較多時，還原能力隨pH值的升高無明顯變化；當pH值較小時，還原能力隨加酶量的增加先升高后下降，上升與下降幅度變化不明顯，當pH值處于7.5～8.0之間，固定pH值，加酶量不斷增加，還原能力先緩慢升高后急劇下降。pH值和加酶量的交互作用對響應值影響極顯著[27]。

由圖6b可知，加酶量4 000 U/g，酶解溫度50 ℃，當pH值在6.5～7.5之間，固定pH值，還原能力隨著酶解時間的延長先升高后下降，上升和下降幅度都很明顯；當pH值高于7.5后，隨著酶解時間的延長，還原能力先迅速升高后緩慢下降，且升高幅度很明顯；當酶解時間較短時，pH值的增大對還原能力影響不大，酶解時間在2.1 h時，還原能力隨pH值的增大上升幅度逐漸變小，達到最大后稍有下降，但下降幅度不明顯。pH值和酶解時間的交互作用對響應值影響極其顯著[27]。

由圖6c可知，pH 7.5，加酶量4 000 U/g，當酶解時間較短時，酶解溫度的升高對還原能力影響不大，整體變化幅度不明顯；當酶解時間在2.1～2.2 h時，酶解溫度在45～51 ℃之間，還原能力隨著酶解溫度的升高逐漸上升并且趨于平穩[27]，酶解溫度51 ℃之后，還原能力隨溫度升高略微下降；當酶解溫度水平較低和較高時，還原能力隨著酶解時間的延長先快速升高后下降，升高幅度明顯。酶解溫度和酶解時間的交互作用對響應值影響較為顯著[29]。

等高線的形狀不同，交互效應的強弱也不同。交互項的等高線圖越近似橢圓形，表明交互作用越強[30]。由圖6的等高線圖可以看出，3 組交互作用中，pH值和酶解時間的交互作用最強，其次是加酶量和pH值的交互作用，而酶解時間和酶解溫度的交互作用最弱，這與表4顯著性檢驗結果完全符合。由響應面圖可知，響應面的最高點為該模型在所選范圍內的最大值[28]。

Design-Expert 8.0.6軟件對試驗的優化結果為加酶量3 600 U/g、pH 7.66、酶解時間2.13 h、酶解溫度50.53 ℃，預測模型的還原能力為0.636 5。結合實際操作情況，將各酶解條件修正為加酶量3 600 U/g、pH 7.7、酶解時間2.1 h、酶解溫度50 ℃，在此條件下進行3 次實驗，得到的結果分別為0.642、0.631和0.659，計算平均值為0.644，與預測值0.636 5接近，說明建立的模型可以更好地預測藜麥糠抗氧化肽的還原能力[24]。在此還原能力下，抗氧化肽的得率為76.25%。

2.4 藜麥糠抗氧化肽對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力

藜麥糠抗氧化肽含有豐富的供氫體，氫質子可以用來還原活性氧自由基，通過終止自由基鏈式反應，使自由基得到清除。

圖7 藜麥糠抗氧化肽用量對超氧陰離子和羥自由基的清除能力Fig. 7 Superoxide anion and hydroxyl radical scavenging capacity of antioxidant peptides at different dosages

從圖7可以看出，當抗氧化肽質量濃度為30 mg/mL時，藜麥糠抗氧化肽對超氧陰離子自由基和羥自由基的清除能力均隨著抗氧化肽體積的增加而上升，存在較好的量效關系。在一定用量范圍內，抗氧化肽對超氧陰離子自由基的清除率均高于羥自由基，而且上升幅度比較明顯。抗氧化活性強這一特性，使藜麥糠抗氧化肽有望更好地被應用到天然抗氧化劑和功能性食品領域，進而研究開發，實現利用價值[17]。

3 討論與結論

以藜麥糠蛋白為原料，首先確定酶解藜麥糠蛋白的最佳復合酶組合，然后通過響應面試驗對酶解工藝條件進行優化，從優化的結果來看，溫度和pH值符合酶的特性，優化結果中酶解時間2.1 h比較適中，說明獲得抗氧化肽并不需要太長的酶解時間，表明酶解時間如果過長一部分具有抗氧化性的肽端會被水解成更小的片段甚至氨基酸，從而致使酶解液的抗氧化性降低[13]。溫建豐等[13]對花蟹肉酶解制備抗氧化肽的工藝進行了優化，其最優參數為用堿性蛋白酶在51 ℃、pH7.5的條件下酶解3.2 h；馮小敏等[23]選用風味蛋白酶與中性蛋白酶1∶1比例組合的復合酶酶解蝦頭，最佳條件為在54 ℃、pH 7.4的條件下酶解3.9 h。以上研究雖采用不同蛋白酶來酶解不同原料蛋白，但最佳酶解溫度和pH值都與本研究較接近，說明酶解不同蛋白制備抗氧化肽存在一定的相似性。為了提高抗氧化肽的純度，使其抗氧化性更好，本實驗需要進行深入研究，具體包括以下內容：運用超濾技術分離純化酶解產物；對純化前后多肽的抗氧化性比較；分析不同分子質量多肽的抗氧化性。

通過比較不同蛋白酶對藜麥糠蛋白的酶解效果，得出選用風味蛋白酶與堿性蛋白酶1∶1比例組合對藜麥糠蛋白進行酶解時，酶解液還原能力最高。根據單因素試驗結果，采用響應面分析法對藜麥糠蛋白酶解工藝進行優化，得到優化組合條件為加酶量3 600 U/g、pH 7.66、酶解時間2.13 h、酶解溫度50.53 ℃，在此條件下驗證實驗，還原能力為0.644。在此還原能力下，抗氧化肽的得率為76.25%。藜麥糠抗氧化肽對超氧陰離子自由基和羥自由基有很強的清除能力，并符合一定的量效關系，為藜麥糠的進一步深加工利用提供了理論支持。

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