褪黑素誘導sts基因表達提高葡萄白藜蘆醇含量

許麗麗，岳倩宇，卞鳳娥，翟 衡，姚玉新*

（山東農業大學園藝科學與工程學院，山東 泰安 271000）

褪黑素不僅是一種廣譜性抗氧化劑，而且具有激素功能，其存在于葡萄果皮、果肉和種子中[1-3]。褪黑素作為抗氧化劑能提高植物的抗旱、抗寒和抗鹽等能力[4-6]。作為激素、褪黑素和生長素IAA具有相似的功能，低濃度促進生長而高濃度抑制生長[7]，褪黑素具有類似IAA的生長抑制效應[8-9]，水稻內源褪黑素水平和根系生長具有直接相關性[10]。盡管褪黑素和IAA具有相似的功能，但是RNA-Seq等數據表明褪黑素對根系生長的調節不依賴于IAA，二者的功能行使相互獨立[11-13]。此外，褪黑素作為激素能改變植物器官發生模式，比如褪黑素處理能誘導黃瓜[14]、櫻桃[15]和石榴[16]不定根和側根的發生。褪黑素能夠改變果實品質，褪黑素處理能增加番茄果實番茄紅素、可溶性固形物和有機酸等含量，促進果實軟化、提高水溶性果膠含量[17-18]。蛋白質組學分析進一步揭示了褪黑素介導的番茄果實成熟的生理和分子機制[19]，241 個受褪黑素誘導的蛋白分別參與不同的果實發育代謝途徑，其中，有8 個蛋白參與花青苷代謝途徑。同時，研究學者發現褪黑素處理延遲了桃采后果實衰老[20]；轉色前褪黑素處理提高了葡萄果實單果質量和果粒成熟一致性，改善了葡萄酒香味[21]。因此，褪黑素對包括果實發育在內的多個生物學過程具有調控作用。

白藜蘆醇屬于非黃酮類酚類化合物，也是一種強的生物活性物質[22]，具有抗氧化性和預防癌癥、心血管等疾病的功能[23-24]，鮮食葡萄是白藜蘆醇的重要食品來源[25]。茋類合酶（stilbene synthase，STS）是白藜蘆醇生化合成的關鍵酶；內源sts基因表達水平和葡萄白藜蘆醇積累水平相一致[26]，過量表達sts基因能夠提高葡萄的白藜蘆醇含量[27-28]。sts屬于查爾酮合酶家族，葡萄上sts家族至少包含40 個成員[26,29-30]。葡萄sts家族成員具有高度保守的基因結構和高的蛋白相似度，系統進化上可以分為3 個組，A組位于染色體10上，B和C組以基因簇的形式串聯排列在染色體16上[29-30]。sts成員在葡萄不同組織和生物、非生物脅迫下具有不同的轉錄模式，不同成員可能響應不同的生物學現象來提高白藜蘆醇含量[29-30]。尤其是葡萄果實中白藜蘆醇的合成和積累與脫落酸（abscisic acid，ABA）濃度相關，而ABA在果實成熟過程中起關鍵作用[23]。以上可知，白藜蘆醇的合成受sts基因家族控制，不同的sts基因在響應上游信號控制白藜蘆醇合成的角色目前還不清楚。

本研究旨在闡明褪黑素作為生長調節物質是否能夠通過調節sts基因表達來促進葡萄中白藜蘆醇的積累，研究結果對于應用褪黑素提高葡萄的營養保健價值具有重要實踐意義，同時也為探索褪黑素調控白藜蘆醇積累的分子機制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料為田間7 a生鮮食與釀酒兼用葡萄品種‘摩爾多瓦’（Vitis vinifera×labrusca, cv. ‘Moldova’）和‘克瑞森無核’（Vitis vinifera cv. ‘Crimson seedless’）組培苗。培養基為MS基本培養基加吲哚丁酸（終質量濃度為0.2 mg/L），培養溫度為（28±1）℃，光照強度為2 000～2 400 lx，光照時間12～14 h。

MS基本培養基 青島高科技生物園海博生物有限公司；吲哚丁酸 索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

RXZ恒溫恒濕培養箱 寧波江南儀器廠；RE-2003型真空旋轉蒸發儀 上海科升儀器公司；Prominenece型高效液相色譜儀 日本島津公司；ABI7500型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀 美國應用生物系統公司。

1.3 方法

1.3.1 前處理及取樣

在葡萄轉色前期用100 μmol/L的褪黑素添加表面活性劑（2%曲拉通）浸泡果實，每穗浸泡10 s，浸泡3 次，每個處理選取20 穗果實，對照除將褪黑素溶液換成清水外，其他處理方式相同；取果實（去種子）用于提取RNA和白藜蘆醇。將長勢一致、繼代培養1 個月的45 株處理組和45 株對照組組培苗同時平均分成12 組（每個重復3 棵），處理組將組培苗根系浸泡在30 μmol/L的褪黑素溶液（滅菌）中，而對照組將褪黑素溶液換為滅菌水，然后分別于不同時間點取樣。所有的樣品材料液氮速凍后，置－80 ℃低溫冰箱保存。

1.3.2 RNA-Seq及數據分析

本部分實驗由北京安諾基因協助完成。方法簡要如下：利用Qubit?3.0 Flurometer檢測RNA純度，利用RNA Nano 6000檢測RNA完整度和濃度。取2 μg RNA，利用NEBNext?Ultra? RNA Library Prep Kit for Illumina?構建RNA文庫，具體步驟參照試劑盒說明書。利用Qubit?RNA Assay Kit檢測文庫RNA質量濃度，稀釋至1 ng/μL；利用Agilent Bioanalyzer 2100 system評價插入大小。然后利用HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS （Illumina）對文庫基因進行聚類，最后構建好的文庫利用Illumina Hiseq 4000平臺測定基因兩端各150 bp的序列。單基因表達水平利用RPKM來計算，log2（倍數變化）大于1和P值小于0.05作為顯著差異表達的閾值。本實驗每個樣品有3 個實驗重復，其平均值用于熱圖制作。利用在線工具制作熱圖（http：//www.omicshare.com/tools/Home/Soft/heatmap）。

1.3.3 系統進化樹的構建

使用ClustalX軟件對葡萄中30 個STS蛋白進行氨基酸序列及該基因家族啟動子序列比對，比對結果通過MEGA5軟件生成進化樹，進化樹的構建采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ），校驗參數Bootstrap重復1 000 次[31]。

1.3.4 順式作用元件分析

利用啟動子在線預測網站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析啟動子上可能結合的順式作用元件，并借助Adobe Photoshop 13.0.0繪圖軟件完成啟動子各個結合元件的繪畫。

1.3.5 qRT-PCR表達分析

各組織RNA提取使用的RNeasy plant mini kit是QIAGEN公司產品（貨號：74903），cDNA第1條鏈的合成采用寶生物（大連）公司產品PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（貨號：DRR047A）。各sts基因的qRT-PCR引物如表1所示，選取actin為內參基因，所有qRT-PCR均設置3 次重復。Ultra SYBR Mixture購自康為試劑公司。所得數據采用2-ΔΔCT進行計算分析[32]。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primers used for fluorescent qRT-PCR

1.3.6 白藜蘆醇含量的測定

白藜蘆醇含量的測定參考韓雅珊等[33]所描述方法并改進：取植物材料在液態氮冷凍，研磨，于1%鹽酸-甲醇提取24 h后，5 000×g離心10 min，收集上清液，沉淀部分用1%鹽酸-甲醇重復提取2次，離心后收集上清液，定容至50 mL，采用真空旋轉蒸發儀（40±2）℃濃縮至2 mL，過0.45 μm微孔濾膜，－40 ℃保存備用。采用高效液相色譜測定，檢測條件：LC-10AT輸液泵，SPD-10A紫外檢測器，安捷倫C18柱（250 mm×4.6 mm），柱溫30 ℃；流動相A為乙腈，流動相B為水（乙酸調pH值至2.6），流速0.500 mL/min；進樣方式為自動進樣，進樣體積10 μL；檢測波長280 nm。

2 結果與分析

2.1 褪黑素處理對sts家族及pal基因表達的影響

為研究褪黑素處理對sts家族基因表達的直接影響，檢測了褪黑素處理6 h后葡萄果實的轉錄組變化。結果表明，與對照相比，351 個基因被顯著上調，18 個基因被顯著下調；其中30 個sts基因被上調，占到總上調基因的8.5%，占目前已發表的葡萄sts基因總數的62.5%；未檢測到下調的sts基因，表明sts家族基因成員廣泛受褪黑素誘導（圖1）。上調幅度分布在1.5～2.3 倍之間，VIT_216s0100g01130、VIT_216s0100g00780、VIT_210s0042g00890和VIT_216s0100g00810上調幅度超過2 倍。此外，轉錄組分析還發現VIT_200s2849g00010、VIT_216s0039g01360、VIT_216s0039g01130、VIT_216s0039g01300、VIT_208s0040g01710和VIT_216s0039g01100這6 個白藜蘆醇合成相關的苯丙氨酸氨裂解酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）基因pal表達被顯著上調。

圖1 褪黑素誘導的sts基因在不同組織的表達Fig. 1 Expression patterns of the melatonin-induced sts genes in different tissues

2.2 褪黑素誘導的sts基因序列及表達特點

30 個受褪黑素誘導的基因包含了定位于10號染色體的5 個sts，即VIT_216s0100g00810、VIT_216s0100g00920、VIT_216s0100g00840、VIT_216s0100g00930和VIT_216s0100g00910；其余25 個sts均定位在16號染色體上。其中，24 個sts基因具有完整的序列信息，氨基酸序列高度相似，達88.3%（圖2）。根據蛋白相似度，24 個STS蛋白可用分為A、B、C組；A組包含12 個STS，蛋白同源性高達91.0%，其中VIT_216s0100g00910和VIT_216s0100g00830同源性最高為99.7%，僅有1 個氨基酸差異；B組僅含有1 個STS；C組含有11 個STS，同源性為96.6%，其中VIT_216s0100g00930和VIT_216s0100g00850同源性最高為99.2%，僅含3 個氨基酸差異（圖2）。

30 個sts基因在不同組織中具有不同的表達模式（圖1）。就愈傷、根、莖和葉而言，絕大部分sts基因在愈傷和根中具有較高的表達水平，尤其是VIT_216s0100g01100表達水平為參比的8 倍以上；果實中，不同的sts表達水平差異也較大，表達量最高的為VIT_216s0100g00830、VIT_216s0100g01020、VIT_216s0100g01170。并且，遺傳距離越近，表達模式越相似，比如，VIT_2160100g00910和VIT_216s0100g00830具有完全相同的表達模式（圖1、2）。

圖2 褪黑素誘導的sts基因編碼蛋白聚類分析Fig. 2 Clustering analysis of the STS proteins encoded by the melatonin-induced sts genes

2.3 sts基因啟動子序列分析

5’-UTR上游1 500 bp的啟動子序列分析表明，24 個sts基因分為A、B、C 3組，A組含有13 個sts，序列相似度為55.6%，其中有4 個sts對應了蛋白聚類的A1組；C組含有9 個sts基因，序列相似度為56.1%，完全屬于蛋白聚類C組（圖2、3）；A組中，VIT_216s0100g00910和VIT_216s0100g00830序列相似度最高，對應了其最高的蛋白相似度；同樣的現象也出現在VIT_216s0100g00930和VIT_216s0100g00850兩個基因上（圖2、3）。因此，總體上看，高的STS蛋白序列對應了高的啟動子序列。在A組中，在啟動子基本核心元件以外發現了一個高度保守的序列，即GG（T/C）TGTTGAG；在B組上也發現了一個基本元件外的保守序列AAGTGGATGAG（A/G）GTTGGTGA。除A1亞組外均含有不同數量的ABA響應元件（ABA response element，ABRE），尤其是B組含有3 個ABRE；A、B組大部分成員均含有乙烯響應元件（ethylene response element，ERE），而C組除VIT_216s0100g00880外均不含ERE；此外，在4 個sts啟動子上發現了生長素響應元件（AuxRR-core）等（圖3）。

圖3 sts基因啟動子順式作用元件分析Fig. 3 Cis acting elements of sts genes in the promoter regions

2.4 果實中sts基因對褪黑素處理的表達響應

為驗證轉錄組數據的可靠性和進一步分析sts基因對褪黑素處理的表達響應，利用qRT-PCR檢測了果實中5 個sts基因在褪黑素處理不同時間的表達水平。VIT_216s0100g00990在果實中受褪黑素強烈誘導，在處理后8 d表達為對照的4.7 倍（圖4D）。相似地，VIT_216s0100g00780和VIT_216s0100g01130在果實中受褪黑素持續誘導，在處理后期表達水平分別為對照的2.7 倍和2.65 倍（圖4B、E）。相比之下，VIT_216s0100g01150和VIT_216s0100g00810在果實中輕微受褪黑素誘導，增幅在1 倍以內（圖4A、C）。由此可知，5 個sts基因不同程度受褪黑素誘導，與轉錄組分析基本一致。

圖4 褪黑素處理不同時間點sts基因在果實中的表達水平Fig. 4 Expression profiles of the sts genes in fruits at different days after melatonin treatment

2.5 根系中sts基因對褪黑素處理的表達響應

考慮到sts基因在根系中具有較高的表達水平，利用qRT-PCR檢測了根系中5 個sts基因在褪黑素處理不同時間的表達水平。VIT_216s0100g01150和VIT_216s0100g01130根系中受褪黑素強烈誘導，在處理后期表達水平分別為對照的3.8 倍和3.35倍（圖5A、E）；VIT_216s0100g00780在根中也受褪黑素持續誘導，后期為對照的2.7 倍左右（圖5B）；相比之下，VIT_216s0100g00810和VIT_216s0100g00990在根中對褪黑素響應不明顯（圖5C、D）。

圖5 褪黑素處理不同時間點sts基因在根系中的表達水平Fig. 5 Expression profiles of the sts genes in root at different days after melatonin treatment

2.6 外源褪黑素處理對白藜蘆醇含量的影響

為了進一步闡明褪黑素處理對白藜蘆醇含量的影響，檢測了褪黑素處理后不同時間果實白藜蘆醇的含量，結果表明，在褪黑素處理后42、63、77 d（果實成熟期），褪黑素均明顯提高了果實白藜蘆醇含量，較對照分別增加了0.90、1.12 倍和1.18 倍（圖6A）。此外，還檢測了褪黑素處理后3 d葡萄根系中的白藜蘆醇含量，結果表明，褪黑素處理大幅度提高了根系白藜蘆醇含量，為對照的3.18 倍（圖6B）。以上研究表明，褪黑素處理葡萄果實和根系，均能提高其白藜蘆醇含量。

圖6 褪黑素處理對果實（A）和根系（B）白藜蘆醇含量的影響Fig. 6 Impacts of melatonin treatment on resveratrol contents in fruit (A)and root (B)

3 討 論

目前，褪黑素對果實品質的影響，尤其是對包括白藜蘆醇在內的次生代謝產物的調節還不清楚。葡萄果實中，褪黑素的積累高峰出現在轉色早期[34-35]，暗示了褪黑素對果實成熟可能具有重要調控作用，因此對轉色初期的葡萄果實進行褪黑素處理，來研究其對白藜蘆醇含量及其合成基因sts表達的影響。本研究中，褪黑素處理導致30 個sts基因表達上調，同時提高了白藜蘆醇含量。相似地，在葡萄組培苗根系中高sts表達對應了高的白藜蘆醇含量[36]。在檢測的5 個sts基因中，僅VIT_216s0100g01130在正常條件下隨果實發育表達明顯上調，表明了不同sts基因在果實發育過程中可能具有不同的作用或者對白藜蘆醇合成具有不同的貢獻；相比之下，在‘Corvina’葡萄果實中，未檢測到受果實成熟誘導的sts基因[29]。研究還發現成熟的‘Pinot noir’葡萄果實積累大量的白藜蘆醇（20 μg/g）[37]，而成熟的‘Corvina’葡萄果實只積累了1.5 μg/g的白藜蘆醇[38]。因此，sts表達水平對白藜蘆醇的合成具有重要作用，葡萄果實中sts表達和白藜蘆醇的積累可能與葡萄基因型有關。

褪黑素對sts的誘導可能基于以下幾個方面。首先，研究已證實褪黑素可以作為信號分子引起細胞核轉錄再編程[2,39]，因此褪黑素可能通過核轉錄再編程來調節sts基因表達。其次，褪黑素處理能影響ABA、乙烯含量[19,40]，水楊酸處理可以顯著提高葡萄品種果皮中的白藜蘆醇含量[41]；本研究中，在褪黑素誘導的sts基因上發現了ABA、水楊酸、乙烯等激素響應元件（圖2），暗示了sts基因可能受以上激素調控；因此，褪黑素可能通過其他激素來間接調控sts基因的表達。再者，研究表明褪黑素處理能通過上調pal等基因的表達提高花青素含量[42]；本研究中褪黑素處理上調了5 個pal表達；因此，褪黑素處理可能通過誘導pal基因表達來提高白藜蘆醇合成所需要的上游底物，進而促進了sts基因表達。

葡萄上絕大多數sts基因分布在16號染色體500 kb的區間內，并且在編碼和非編碼區都存在大量的同源區域，暗示了sts家族主要來自于串聯重復和片段重復復制[29]。本研究30 個褪黑素誘導的STS蛋白和啟動子序列具有高度相似性，并且在啟動子區發現了高度保守的基元，暗示了這些sts可能具有相同的褪黑素響應元件。在褪黑素誘導的30 個sts基因中，僅個別存在IAA響應元件，暗示了褪黑素和IAA可能具有不同的靶基因調節和信號轉導途徑[2]。葡萄基因組大小為487 Mb，其中85 Mb來自基因組重復復制，尤其是染色體16，重復復制率達25.08%[43]。葡萄基因組在幾個次生代謝相關的基因家族上發生了顯著的復制、擴張[44]；此類基因的拷貝數的增加是植物調節性進化的主要動力之一[45-46]。就sts基因而言，葡萄sts家族比其他作物sts家族大10 倍[30]；但在單子葉高粱上sts以單拷貝存在[47]，暗示了sts多拷貝事件可能發生在單、雙子葉植物分化之后。并且，葡萄上至少32 個sts基因具有合成白藜蘆醇的功能，不同sts的功能可能具有冗余性[30]；但本研究中不同處理時間的表達響應表明，除了功能冗余外不同的sts對褪黑素誘導的白藜蘆醇提高可能具有不同的作用。

4 結 論

葡萄sts基因具有保守的啟動子和蛋白質序列。大量的葡萄sts基因在果實中能響應褪黑素處理，但具有不同的響應模式。褪黑素處理誘導了sts基因的表達進而提高了組織中白藜蘆醇含量。

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