不同酵母和氮源對篤斯越橘果酒香氣的影響

魏 銘，趙萊昱，楊航宇，吳玉文，李 騰，王紹陽，朱保慶，張柏林,*

（1.北京林業大學生物科學與技術學院，林業食品加工與安全北京市重點實驗室，北京 100083；2.中國長城葡萄酒有限公司，河北 張家口 075400）

篤斯越橘（Vaccinium uliginosum L.），杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）植物，是生長在我國東北大興安嶺和長白山等地區的一種野生藍莓[1]，其果實中含有豐富的營養物質，如花色苷、有機酸、維生素和微量元素等[2-4]，具有抗氧化、預防心腦血管疾病、抗腫瘤、保護視力等多種生理功能[5-8]。篤斯越橘具有含糖量低、含酸量高、不易貯藏等特點，多加工成果干、果醬或果酒等產品消費[9-10]。篤斯越橘果酒的風味主要依賴于酒中所含的糖、單寧和酸類物質，除此之外其本身及其在釀造過程中所呈現的特殊香氣成分也是篤斯越橘果酒風味的主要組成部分。

香氣成分是決定果酒風味、品質和典型性的重要因素[11-12]。篤斯越橘果酒的香氣組成直接影響其感官品質，是構成高品質篤斯越橘果酒的一個重要指標。香氣物質的種類、濃度及其和諧程度決定了篤斯越橘果酒的協調性、復雜性和典型性[13]。酵母代謝是產生果酒香氣的途徑之一，并與發酵基質中的氮源關系密切，氮源同時也是果酒中某些芳香物質的前體。目前對篤斯越橘香氣成分的研究已有報道，但是比較不同酵母和不同氮源對篤斯越橘果酒香氣影響的研究較少，且研究品種多集中于栽培藍莓[14-16]，對篤斯越橘發酵酒香氣的研究尚不多見。

頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用法是目前廣泛用于食品檢驗、大氣分析、生化和醫學領域的高效檢測技術，是酒類香氣成分鑒定強有力的分析工具[17-18]。本實驗以篤斯越橘為原料，分別選用釀酒酵母Red Fruit（以下簡稱為RF）和Vintage Red Challenge（以下簡稱為VRC），輔助添加無機氮源磷酸氫二銨（dibasic ammonium phosphate，DAP）和有機氮源NutriStart（以下簡稱為NS）進行發酵，采用頂空固相微萃取結合GC-MS聯用技術，分析不同酵母和氮源種類對篤斯越橘發酵酒香氣品質的影響，以期為篤斯越橘果酒的科學釀造提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酵母與氮源

酵母和氮源商業釀酒干酵母RF和VRC 意大利Enartis公司；DAP 天津市鳳船化學試劑科技有限公司；有機氮源酵母營養劑NS 法國Laffort公司。

1.1.2 酒樣

發酵工藝參考文獻[19]，以大興安嶺野生篤斯越橘為原料進行壓榨，在壓榨過程中在線添加SO2，使最終SO2的質量濃度為45 mg/L。調整果汁的糖質量濃度為240 g/L，酸度至pH 3.3；分別加入DAP（300 mg/L）或有機氮源酵母營養劑NS（450 mg/L），按0.2 g/L接入活化好的RF和VRC商業活性釀酒酵母。在室溫條件下（17～23 ℃），采用5 L發酵罐進行發酵。在發酵過程中進行監控（測定溫度和比重），當比重連續3 d不下降或還原糖的含量不在發生變化時，即可認為發酵終止。發酵結束后調整SO2的質量濃度至40 mg/L，滿罐封存，用于理化指標和香氣成分分析。

1.1.3 試劑

45 種香氣物質標準品 美國Sigma公司；氫氧化鈣、無水碳酸鈉（均為分析純） 北京化工廠；偏重亞硫酸鉀（分析純） 意大利Enartis公司。

1.2 儀器與設備

0.9-1.0、1.0-1.1比重計 上海逸川儀器儀表廠；FA 204電子分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；固相萃取柱 天津博納艾杰爾科技有限公司；6890-5975型GC-MS聯用儀、HP-INNOWax色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標測定

依據GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》對乙醇體積分數、還原糖、總酚等理化指標進行測定。

1.3.2 樣品預處理

頂空固相微萃取與GC-MS聯用分析條件參照朱保慶等[20]的方法，稍作修改。取5 mL待測篤斯越橘果酒樣品于15 mL的樣品瓶中，加入1g NaCl，用帶有聚四氟乙烯隔墊的瓶蓋旋緊密封，于40 ℃條件下在磁力攪拌加熱臺上加熱攪拌30 min，用已活化的固相微萃取頭插入樣品瓶頂空處，相同溫度條件下加熱吸附30 min。取下萃取頭后立即在GC進樣口于250 ℃條件下解吸8min。

GC-MS條件：采用6890-5975型GC-MS聯用儀，HP-INNOWax色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣，流速1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；熱解吸25 min。升溫程序：40 ℃保持5 min，然后以3 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持2 min。質譜接口溫度280 ℃；電子電離源；離子能量70 eV；質量掃描范圍20～350 u。每個樣品做2 次平行測定。

1.3.3 定性和定量方法

依據已有標準品的色譜保留時間和質譜信息以及NIST 08標準譜庫比對結果，采用自動質譜解卷積和鑒定系統軟件對化合物進行定性。對于已有標準品的物質，利用以混標法制備的標準曲線進行定量分析，對于沒有標準品的香氣物質，根據與其化學結構相似、碳原子數相近的標準品的標準曲線進行定量。

1.3.4 香氣活性值計算

香氣活性值是評價葡萄酒揮發性組分對實際香氣貢獻大小所普遍采用的一個指標，目前國內外已有許多研究應用該指標對果酒揮發性組分的香氣貢獻進行評價。每種揮發性組分的香氣活性值為該物質的濃度與其嗅覺閾值的比值，本研究中各物質的嗅覺閾值和氣味描述均參考文獻[21]。

1.4 數據處理與統計

每個樣品重復實驗3 次，結果以 ±s表示；平均值、標準偏差和標準曲線等通過Microsoft Excel 2013軟件進行分析；采用SPSS 22.0統計分析軟件（SPSS Inc., Chicago,IL, USA）進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同條件發酵篤斯越橘果酒的發酵速率

圖1 各組篤斯越橘果酒的發酵速率Fig. 1 Fermentation rate curves of bog bilberry wine

如圖1所示，相對密度由比重計直接測定，當相對密度連續3 d不再改變時認為發酵終止。采用RF酵母發酵的2 組篤斯越橘果酒的發酵速度明顯快于采用VRC酵母發酵的2 組篤斯越橘果酒；RF酵母發酵的2 組酒樣發酵曲線較為相似，均在14 d左右發酵終止；VRC酵母發酵的2 組酒樣中，采用DAP氮源的發酵速度稍快于采用NS氮源的酒樣。

2.2 不同條件發酵篤斯越橘果酒的理化指標

表1 不同酵母和氮源發酵篤斯越橘果酒的理化指標Table 1 Characteristics of bog bilberry wines fermented with different yeast species and nitrogen sources

如表1所示，發酵酒的還原糖受氮源種類影響較大，使用無機氮源的2 種處理（RF＋DAP和VRC＋DAP）顯著低于使用有機氮源的處理（RF＋NS和VRC＋NS）。與有機氮相比，無機氮容易被酵母利用，從而可以更大程度地增加釀酒酵母的活性，使發酵進行得更徹底[22]。2 種酵母（RF和VRC）對發酵酒還原糖含量影響不顯著。相對應的，發酵時間和總酚含量受酵母種類影響比受氮源種類的影響大。RF酵母發酵速度快，14～15 d可以完成發酵（比重連續2 d不下降）；而使用VRC酵母時，接種后至發酵終止需22～24 d。VRC酵母發酵的酒樣中酚類物質質量濃度為725～771 mg/L，顯著少于RF酵母發酵的酒樣（843～948 mg/L）。

2.3 不同條件發酵篤斯越橘果酒中香氣成分GC-MS分析

表2 篤斯越橘果酒中香氣物質組成Table 2 Aroma composition of bog bilberry wine

續表2

4 種處理條件下發酵的篤斯越橘果酒香氣成分的鑒定結果見表2，GC-MS總離子流色譜圖見圖2。在所有酒樣中共鑒定出86 種香氣成分，酯類化合物最多，有32 種，其次為醇類18 種，萜烯類13 種，酸類10 種，醛酮類7 種，以及其他類6 種，檢測結果與文獻[13,23]報道一致。4 種酒樣含量最多的香氣成分均為異戊醇、異丁醇、乙酸乙酯以及乙偶姻，質量濃度分別為490～753、253～349、90～153 mg/L以及89～178 mg/L。酯類物質閾值低，對果酒主體香氣貢獻最為顯著，對篤斯越橘果酒的香氣影響最大；醇類、酸類物質閾值較高，對香氣成分影響有限。

圖2 各組篤斯越橘果酒香氣成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig. 2 GC-MS chromatogram of bog bilberry wine

在RF酵母和DAP氮源發酵的酒中共鑒定出86 種香氣成分，其中大于閾值的有20 種；在RF酵母和NS氮源發酵的酒中共鑒定出80 種香氣成分，其中大于閾值的有18 種；在VRC酵母和DAP氮源發酵的酒中共鑒定出79 種香氣成分，其中大于閾值的有17 種；在VRC酵母和NS氮源發酵的酒中共鑒定出79 種香氣成分，其中大于閾值的有18 種。有研究表明，不同的酵母種類會在發酵過程中影響到高級醇及酯類的含量和比例，從而導致果酒最終出現香氣特征差異[24]。無機氮源含有的營養成分比有機氮單一很多，但有機氮源的使用并沒有使香氣增加，可能是由于無機氮源更容易被酵母利用。從發酵速率也可以看出（圖1），添加無機氮源的酒樣，發酵速率比添加有機氮源快。研究表明，添加有機氮源的酒樣，高級醇含量過高，從而會影響酒的品質；本實驗中，只有VRC酵母發酵的酒樣，添加有機氮源產生的高級醇相對較多。此外，無機氮源被證實可使酒樣中丁酸乙酯含量升高，這與本實驗研究結果一致[25]。

2.4 不同條件下發酵篤斯越橘果酒的主要香氣成分比較

2.4.1 醇類組分的比較

醇類化合物是酒中主要的香氣物質，總含量最高。4 種酒樣共檢測出醇類物質18 種，共有14 種。其中含量最高的物質為異戊醇和異丁醇，質量濃度分別達到490～753 mg/L和253～349 mg/L，與前人研究一致，蓋禹含[15]和嚴紅光[16]等研究均表明3-甲基-1-丁醇（即異戊醇）是篤斯越橘果酒含量最高的香氣物質，異戊醇具有青草和植物香氣。此外，檢測結果表明，1-丁醇、1-癸醇以及十二醇為RF酵母和DAP發酵的篤斯越橘果酒所特有，在其他3 種酒中均未檢出。

2.4.2 酯類組分的比較

發酵過程酒樣中的高級醇來源于氨基酸的降解，其濃度直接影響果酒香氣[19]。4 種酒共檢測出32 種酯類化合物，共有31 種，其中質量濃度最高的物質為乙酸乙酯，為90～153 mg/L，乙酸乙酯能賦予篤斯越橘果酒柔和的果香和奶油味[26]；其他對香氣有顯著貢獻的酯類化合物還有乙酸異戊酯、辛酸乙酯、2-羥基-4-甲基戊酸乙酯等，這些化合物通常具有花香或果香味，如乙酸異戊酯具有強烈果香，似香蕉、梨的酸甜味[10]。可以看出，由于采用相同的原料發酵，不同酒中的酯類化合物種類和含量表現出了較高的相似性。

2.4.3 酸類組分的比較

酸類是篤斯越橘果酒中重要的協調成分，不僅影響酒的感官品質，而且對花色苷等物質具有保護作用[27]。4 種酒共檢測出酸類物質10 種，香氣活性值大于1的香氣化合物共有4 種，分別是己酸、辛酸、癸酸以及9-癸烯酸，其中癸酸的含量僅在RF酵母發酵的2 種酒中超過了閾值，類似地，采用RF酵母發酵的酒中其他酸類物質的含量大多也高于采用VRC酵母發酵的酒。

2.4.4 萜烯類和降異戊二烯類組分的比較

萜烯是酒中重要的呈香物質，果酒中的萜烯主要來源于果實，隨著釀造和陳釀過程的進行，果實中的糖苷結合態萜類會通過酶解或酸解作用形成游離態的萜類芳香成分，從而增強果酒的風味[28]。4 種酒共檢測出萜烯類化合物13 種，有12 種為4 種酒所共有，蛇麻烯僅在RF酵母發酵的2 種酒中檢出。萜烯類物質的含量雖然不高，但由于某些萜烯的閾值很低，所以對酒的香氣也有著十分重要的影響。在檢測到的萜烯化合物中香氣活性值最大的化合物是β-大馬士酮，它帶有玫瑰花香和異域香氣[13]，在所有萜烯類化合物中對香氣的貢獻最為顯著，其他萜烯類物質的含量均未超過閾值。

2.4.5 醛酮類組分的比較

果酒發酵過程中，不飽和脂肪酸能夠在脂氧合酶的作用下，代謝產生醛和酮[29]。4 種酒中共檢測到7 種醛酮類化合物，含量均較少，大多以痕量存在，只有癸醛含量超過了閾值，另外，在RF酵母和NS氮源發酵的酒中檢測到少量蕓香酮，其他3 種酒樣中未檢出這2 種物質。

2.4.6 其他組分的比較

在篤斯越橘果酒中還檢測到2-乙酰基呋喃、γ-丁內酯、乙偶姻、傘花烴、3-甲硫基丙醇以及萘。除乙偶姻以外的其他化合物的含量均較少，在酒中痕量存在或含量遠低于閾值；乙偶姻可產生令人愉快的奶油香氣[30]，在酒中質量濃度達到89～178 mg/L，在RF酵母和DAP作為氮源發酵的酒與VRC酵母和NS氮源發酵的酒中乙偶姻的含量超過了閾值。

2.5 香氣輪廓圖

圖3 不同酵母和氮源發酵的篤斯越橘果酒香氣輪廓圖Fig. 3 Aroma profiles of bog bilberry wines fermented with different yeast species and nitrogen sources

食品中的香氣成分含量并不能完全反映其對整體香氣貢獻的大小，需結合香氣閾值考慮呈香組分的香氣活性值[31]。為了更好地體現香氣類型與組間差異，對各組分篤斯越橘果酒的香氣活性值取以10為底數的對數值，繪制香氣輪廓圖，如圖3所示。香氣活性值為香氣化合物的含量與感官閾值的比值，數值越大表示該香氣越突出。4 種處理生產的篤斯越橘果酒香氣輪廓較為相似：果香最濃，隨后是脂香和甜香，花香、化學味和青草香較弱。雖然能檢測到個別呈現堅果、焦糖和烘烤風味的化合物，但均未達到閾值。4 種酒樣相比，RF＋DAP處理的酒樣香氣最為濃郁，果香、脂香和甜香的香氣活性值均遠高于其他3 種處理的酒樣，這表明RF酵母產生香氣的能力明顯高于VRC，此外，與有機氮源（NS）相比，無機氮源（DAP）成分單一，質量較穩定，可被酵母快速利用，產生香氣成分的種類和含量增多[21]。

3 結 論

本實驗分析了不同酵母和氮源處理條件下發酵篤斯越橘果酒香氣成分的變化，采用RF酵母和DAP作為氮源的果酒發酵速度更快，發酵的殘糖量更少，表現出了一定的發酵優勢。香氣分析表明，盡管4 種處理條件下的果酒香氣化合物表現出一定的相似性，但仍存在種類和含量上的顯著區別，采用RF酵母和DAP氮源的酒樣香氣化合物種類最多，總量也高于其他處理果酒酒樣，該研究為提升篤斯越橘釀造果酒的品質提供了理論依據。

參考文獻：

[1]劉樹勛, 劉恩超, 陳晨, 等. 橡木片對篤斯越橘果酒顏色和酚類物質含量的影響[J]. 食品工業科技, 2016, 37(9): 150-154. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.021.

[2]胡濟美, 籍保平, 周峰, 等. 大興安嶺篤斯越橘花色苷成分鑒定研究[J].食品科學, 2009, 30(10): 239-241. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2009.10.056.

[3]魏銘, 顧盼, 李程潔, 等. 高效液相色譜法測定篤斯越桔制品中7 種有機酸的含量[J]. 中國釀造, 2014, 33(11): 145-148. DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.033.

[4]胡雅馨, 李京, 惠伯棣. 藍莓果實中主要營養及花青素成分的研究[J]. 食品科學, 2006, 27(10): 600-603. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2006.10.154.

[5]COLAK N, TORUN H, GRUZ J, et al. Bog bilberry phenolics,antioxidant capacity and nutrient profile[J]. Food Chemistry, 2016,201: 339-349. DOI:10.1016/j.foodchem.2016.01.062.

[6]韓鵬祥, 張蓓, 馮敘橋, 等. 藍莓的營養保健功能及其開發利用[J]. 食品工業科技, 2015, 36(6): 370-375. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.072.

[7]劉樹勛, 楊航宇, 王紹陽, 等. 野生藍莓酒皮渣花色苷及其抗氧化活性研究[J]. 中國釀造, 2016, 35(2): 115-118. DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.026.

[8]宋雪, 韓勇, 籍保平, 等. 篤斯越橘花色苷提取物對光損傷人視網膜色素上皮細胞的保護作用[J]. 食品科學, 2010, 31(21): 324-328.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201021073.

[9]陳晨, 劉樹勛, 王紹陽, 等. PET瓶儲條件對藍莓酒顏色和酚類物質含量的影響[J]. 食品工業科技, 2017(1): 322-327. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2017.01.057.

[10]LIU S X, YANG H Y, LI S Y, et al. Polyphenolic compositions and chromatic characteristics of bog bilberry syrup wines[J]. Molecules,2015, 20(11): 19865-19877. DOI:10.3390/molecules201119662.

[11]王家利, 辛秀蘭, 陳亮, 等. 氣相色譜-質譜法分析比較不同酵母發酵紅樹莓果酒的香氣成分[J]. 食品科學, 2014, 35(6): 107-112.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201406022.

[12]楊旭, 陳亮, 辛秀蘭, 等. 果汁發酵和帶渣發酵藍靛果酒香氣成分分析[J]. 食品科學, 2014, 35(12): 115-119. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201412022.

[13]李華. 現代葡萄酒工藝學[M]. 西安: 陜西科學技術出版社, 1995:106-115.

[14]UGLIANO M, TRAVIS B, FRANCIS I L, et al. Volatile composition and sensory properties of Shiraz wines as affected by nitrogen supplementation and yeast species: rationalizing nitrogen modulation of wine aroma[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2010,58(23): 12417-12425. DOI:10.1021/jf1027137.

[15]蓋禹含, 辛秀蘭, 楊國偉, 等. 不同酵母發酵的藍莓酒香氣成分GC-MS分析[J]. 食品科學, 2010, 31(4): 171-174. DOI:10.7506/spkx1002-6300-201004038.

[16]嚴紅光, 張文華, 丁之恩. 不同酵母菌發酵對藍莓果酒香氣物質影響研究[J]. 食品科技, 2013, 38(5): 94-97. DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2013.05.049.

[17]李賀賀, 胡蕭梅, 李安軍, 等. 采用頂空固相微萃取和攪拌棒吸附萃取技術分析古井貢酒中香氣成分[J]. 食品科學, 2017, 38(4): 155-164. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704025.

[18]張源麟, 董建軍, 郝俊光, 等. 頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法同時檢測啤酒釀造大米中16 種風味物質含量[J]. 食品科學, 2015,36(22): 75-79. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201522013.

[19]OUYANG X Y, ZHU B Q, LIU R L, et al. Comparison of volatile composition and color attributes of mulberry wine fermented by different commercial yeasts[J]. Journal of Food Processing &Preservation, 2017: e13432. DOI:10.1111/jfpp.13432.

[20]朱保慶, 溫可睿, 王軍, 等. 利用AMDIS技術解析雷司令果實發育過程中的降異戊二烯類香氣物質[J]. 中外葡萄與葡萄酒, 2011(6): 4-9.DOI:10.13414/j.cnki.zwpp.2011.11.001.

[21]CAI J, ZHU B Q, WANG Y H, et al. Influence of pre-fermentation cold maceration treatment on aroma compounds of Cabernet Sauvignon wines fermented in different industrial scale fermenters[J]. Food Chemistry, 2014, 154(2): 217-229. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.01.003.

[22]WANG S Y, LI Y Q, LI T, et al. Dibasic ammonium phosphate application enhances aromatic compound concentration in Bog bilberry syrup wine[J]. Molecules, 2016, 22(1): 52-71. DOI:10.3390/molecules22010052.

[23]李小惠, 陳燕, 韋廣鑫, 等. 藍莓果酒陳釀期間香氣成分變化研究[J].釀酒科技, 2016(9): 65-70. DOI:10.13746/j.njkj.2016180.

[24]HOUTMAN A C, PLESSIS C D. Nutritional deficiencies of clarified white grape juices and their correction in relation to fermentation[J].South African Journal of Enology and Viticulture, 1986, 7(1): 39-46.DOI:10.21548/7-1-2345.

[25]TORREA D, VARELA C, UGLIANO M, et al. Comparison of inorganic and organic nitrogen supplementation of grape juice-effect on volatile composition and aroma profile of a Chardonnay wine fermented with Saccharomyces cerevisiae yeast[J]. Food Chemistry,2011, 127(3): 1072-1083. DOI:10.1016/j.foodchem.2011.01.092.

[26]楊瑩, 徐艷文, 薛軍俠, 等. 葡萄酒相關酵母的香氣形成及香氣特征[J]. 微生物學通報, 2007, 34(4): 757-760. DOI:10.3969/j.issn.0253-2654.2007.04.033.

[27]徐玉濤, 李珂珂, 王賀新, 等. 高效液相色譜法對藍莓果實中8 個有機酸含量的測定[J]. 食品科學, 2015, 36(18): 127-131. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201518023.

[28]MATEO J J, JIMéNEZ M. Monoterpenes in grape juice and wines[J].Journal of Chromatography A, 2000, 881(1/2): 557-567. DOI:10.1016/S0021-9673(99)01342-4.

[29]OUYANG X Y, YUAN G S, REN J, et al. Aromatic compounds and organoleptic features of fermented wolfberry wine: effects of maceration time[J]. International Journal of Food Properties, 2016,20(10): 2234-2248. DOI:10.1080/10942912.2016.1233435.

[30]王之建, 賈衛民, 李喜彥. 乙醛催化制備乙偶姻[C]//2004年中國香料香精學術研討會論文集, 2004.

[31]鮑杰, 李瑩燦, 劉雅冉, 等. 篤斯越橘果醬特征香氣成分分析[J].食品與發酵工業, 2017, 43(6): 255-262. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706044.