AB-8大孔樹脂純化綠豆皮黃酮工藝優化及純化前后抗氧化能力比較

李 俠，臧學麗，徐祎博，王大為,*

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.長春醫學高等專科學校，吉林 長春 130031；3.遼源市糧油衛生檢驗監測站，吉林 遼源 136200）

綠豆又稱為青小豆或植豆[1]，在我國有悠久的種植歷史，年產量約100萬 t，遠高于印度、緬甸、泰國等綠豆生產國[2-3]。綠豆生產加工過程中產生大量的綠豆皮，這些綠豆皮除了少量被用作動物飼料外，大部分被當作廢料而拋棄掉，不僅給環境造成了嚴重污染，也給資源造成了極大浪費。綠豆皮中主要成分為膳食纖維，還含有黃酮類、多酚類、生物甾醇、生物堿、香豆素等多種功能性成分[4-6]，其中黃酮類化合物是綠豆皮中重要的功效成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化[7-9]、增強免疫調節作用[10-11]、降低血脂和膽固醇[12-14]及預防高血壓[15]等多種生理功能。

黃酮類化合物的分離純化方法很多，常見的有重結晶法、溶劑萃取法、樹脂法、膜分離法、高速離心分離法等[16-18]。重結晶法是利用黃酮類化合物不溶于酸溶液、易溶于堿溶液及丙酮和乙醇的性質，將黃酮類化合物與其他物質成分分離，進而達到純化的目的，重結晶的次數越多，被純化物質的純度越高[19]。但在重結晶過程中，往往要通過多次重結晶，才能獲得純度較高的黃酮類化合物，所以重結晶法操作起來比較耗時、耗力。溶劑萃取是利用黃酮類化合物在兩種互不相溶或微溶的溶劑中溶解度或分配系數的不同，使黃酮類化合物從一種溶劑轉移到另一種溶劑中，經過反復多次萃取，將黃酮化合物分離出來。萃取時，黃酮類化合物在兩相溶劑中分配系數相差越大，分離效率越高[20]，但溶劑萃取法在萃取過程中有機溶劑易揮發，對人體易造成傷害，而且手工操作比較麻煩、費時費力、且分離效率也不高。膜分離法是利用人工合成的、具有選擇透過性的膜作為分離介質，在一定的推力作用下，實現料液中不同組分的分離[21-22]。膜分離法適合分子質量差別較大的黃酮類化合物的分離，對于分子質量相差較小，化學結構相似的黃酮類物質則不適用[23-24]。高速離心分離法是利用待分離物質與其混合的物質間密度不同，在高速運轉的離心機離心力的作用下，進行分離的物理分離分析技術，但該分離方法不適合分子質量較小的黃酮類物質的分離。樹脂法在分離純化中應用比較廣泛，其原理是利用樹脂與黃酮類化合物相結合，使其與雜質分離，再用洗脫劑洗脫樹脂上的目標物或讓雜質與樹脂結合，將目標物洗脫出來。由于大孔樹脂具有較好的選擇性、吸附量大、吸附速度快、再生方便等特點，所以廣泛應用于天然化合物的初步分離。

本實驗采用AB-8大孔樹脂對綠豆皮粗提物進行純化，以達到產品初步分離的目的，并采用紫外-可見光譜和傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）掃描，驗證初步純化后黃酮類化合物的存在，應用掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）對綠豆皮黃酮粗提物和初步純化物進行微觀分析，分析純化后黃酮類化合物純度提高的原因，為綜合開發綠豆皮資源提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆丁標準品（純度≥98%） 美國Sigma公司；無水乙醇、三氯化鋁、石油醚、鹽酸、溴化鉀（均為分析純） 北京化工廠；纖維素酶（酶活性≥150 U/mg）上海惠世生化試劑有限公司；聚酰胺樹脂（80～100 目）國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；LXJ-IIB低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠；UB-7酸度計 德國賽多利斯股份公司；IRPrestge-21 FTIR儀、JSM-6610A SEM儀 日本島津公司；AUY220分析電子天平 上海精天電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 綠豆皮黃酮粗提物的制備

前期實驗采用超聲波-酶法提取綠豆皮黃酮類化合物，得到最優條件為料液比1∶30（g/mL）、超聲功率192 W、超聲時間28 min、加酶量0.24%、酶解時間40 min，提取液真空抽濾后加入硅藻土，去除大分子蛋白和糖，再次抽濾，石油醚萃取，下層萃取液濃縮，冷凍干燥后，測得綠豆皮黃酮類化合物的純度為27.95%，收集備用。

1.3.2 動態吸附泄漏曲線的繪制

在大孔樹脂動態吸附過程中，當對有效成分的吸附量達到飽和時，有效成分吸附會被減弱或消失，這時有效成分則從樹脂上泄漏流出，所以有必要對大孔樹脂做動態吸附研究，為大孔樹脂的用量和被分離物的上樣量提供實驗依據。

準確稱取預處理后的AB-8大孔樹脂2 g，裝柱，將質量濃度為1.5 mg/mL的綠豆皮黃酮粗提液pH值調至5.0，以1 mL/min的上樣流速進行連續上樣，流出液10 mL收集成1 管，測定每管樣液的吸光度，計算流出液中黃酮類化合物的質量濃度，以流出液體積為橫坐標，黃酮類化合物質量濃度為縱坐標，繪制AB-8大孔樹脂動態泄漏曲線。

1.3.3 AB-8大孔吸附樹脂純化綠豆皮黃酮類化合物上樣條件的優化

在吸附過程中，大孔樹脂的極性、孔徑以及上樣液質量濃度、流速等都是影響大孔樹脂吸附量重要因素，從而影響被分離物分離純化效果[25-27]，為使綠豆皮黃酮類化合物更好得到分離，本實驗以上樣液質量濃度、上樣液pH值、上樣流速為試驗因素，分別考察3 個因素對綠豆皮黃酮類化合物吸附量的影響。動態吸附量的計算公式見式（1）：

式中：C0、C1分別為上柱前原液和上柱后流出液中黃酮化合物的質量濃度/（mg/mL）；V0、V1分別為上柱前原液和上柱后流出液體積/mL；M為大孔樹脂質量/g。

1.3.3.1 單因素試驗

準確稱取處理好的AB-8大孔樹脂，每份2 g，分別裝入玻璃柱中，以對黃酮類化合物吸附量為考察指標，將綠豆皮黃酮提取液分別以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的上樣液質量濃度，以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min上樣流速，pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，上柱層析，收集流出液，測定吸光度，計算吸附量，考察3 個因素對黃酮類化合物吸附量的影響。

1.3.3.2 正交試驗

在單因素試驗結果的基礎上，以對黃酮類化合物吸附量為考察指標，采用L9（34）正交表進行試驗，優化上樣條件，因素與水平見表1。

表1 L9（34）正交試驗因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used in L9 (34)orthogonal array design

1.3.4 AB-8大孔吸附樹脂分離綠豆皮黃酮類化合物洗脫條件的優化

影響大孔樹洗脫效果的因素除了樹脂本身所具有的物理、化學性質外，還與洗脫劑的種類、洗脫劑體積分數、以及洗脫劑的用量和流速等有關[28]。準確稱取處理好的AB-8大孔樹脂2 g，裝入玻璃柱中，以1.3.3節中篩選出的最優條件進行上樣后，用蒸餾水洗至流出液呈無色透明，再進行單因素洗脫試驗，考察洗脫劑體積分數、洗脫劑用量以及洗脫流速對解吸率的影響。解吸率按式

（2）計算：

式中：C0、C1、C2分別為上柱前原液、上柱后流出液和洗脫后的洗脫液中黃酮化合物質量濃度/（mg/mL）；V0、V1、V2分別為上柱前原液、上柱后流出液和洗脫后的洗脫液體積/mL。

1.3.4.1 洗脫劑體積分數對解吸率的影響

準備5 根玻璃層析柱，裝柱上樣后，分別以體積分數10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液以2 mL/min的流速進行洗脫，洗脫劑用量為5 BV（床體積），收集洗脫液，測定洗脫液中黃酮類化合物的含量，各取0.5 mL，測定其吸光度，計算每個柱子在各洗脫體積分數下的動態解吸率，考察洗脫劑體積分數對解吸率的影響。

1.3.4.2 洗脫劑用量對解吸率的影響

準備5 根玻璃層析柱，裝柱上樣后，以體積分數70%乙醇溶液以2 mL/min的流速進行洗脫，洗脫劑用量分別為45、90、135、180、225、270 mL，收集洗脫液，測定洗脫液中黃酮化合物的含量，各取0.5 mL，測定吸光度，計算每個柱子在各洗脫劑用量下的動態解吸率，考察洗脫劑用量對解吸率的影響。

1.3.4.3 洗脫流速對解吸率的影響

準備5 根玻璃層析柱，裝柱上樣后，以70%乙醇溶液為洗脫溶劑，分別以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL/min的洗脫流速進行洗脫。收集洗脫液，測定洗脫液中黃酮類化合物的含量，各取0.5 mL，測定吸光度，計算每個柱子在不同洗脫速度下的動態解吸率，確定洗脫流速。

1.3.5 AB-8大孔吸附樹脂分離綠豆皮黃酮類化合物洗脫特性曲線的繪制

按照1.3.3節確定的最佳上樣條件和1.3.4節的洗脫條件進行上樣洗脫，洗脫液每10 mL收集成1管，每管各取0.5 mL，測定每管洗脫液的質量濃度，以洗脫體積為橫坐標，洗脫下來的黃酮類化合物質量濃度為縱坐標，繪制洗脫曲線。

1.3.6 純度計算

黃酮類化合物的純度按公式（3）進行計算：

1.3.7 綠豆皮黃酮類化合物的鑒定分析

1.3.7.1 紫外-可見光譜掃描分析

取樣品溶液少量，用75%乙醇溶液稀釋后，放入紫外-可見分光光度計中，在波長200～600 nm范圍進行光譜掃描。

1.3.7.2 FTIR掃描分析

將干燥后的樣品準確稱量1 mg，KBr烘干后稱取100 mg，研磨混合均勻后，壓片，放入FTIR儀，采用紅外光譜透射法進行掃描。掃描條件為：波數4 000～400 cm－1，分辨率4 cm－1，掃描32 次。

1.3.7.3 SEM分析

分別取干燥后的綠豆皮黃酮粗提物和經AB-8大孔樹脂純化后的樣品各少量，置于墊片上，樣品表面進行噴金處理后，放入SEM下掃描。

1.3.8 抗氧化能力的測定

1.3.8.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力

準確稱取DPPH 20 mg，用無水乙醇定容至250 mL容量瓶中，DPPH溶液濃度為2×10－4mol/L，待用；將VC（對照）、綠豆皮黃酮純化物、綠豆皮黃酮粗提物用無水乙醇配制成不同質量濃度的待測液，待用。

1）用移液槍移取待測液100 μL與DPPH溶液4 mL置于具塞試管中，搖勻，靜止30 min后，以無水乙醇為參比，在517 nm波長下測定吸光度Ai。2）用移液槍移取待測液100 μL與無水乙醇4 mL置于具塞試管中，搖勻，靜止30 min后，以無水乙醇為參比，在517 nm波長下測定吸光度Aj。3）用移液槍移取無水乙醇100 μL與DPPH溶液4 mL置于具塞試管中，搖勻，靜止30 min后，以無水乙醇為參比，在517 nm波長下測定吸光度Ac。利用公式（4）計算待測物對DPPH自由基清除率：

1.3.8.2 羥自由基清除能力

將綠豆皮黃酮純化物和粗提物以及VC配制成不同質量濃度的待測液，待用。取各待測液100 μL置于不同錐形瓶內，各加入100 μL的6 mmol/L硫酸亞鐵溶液和100 μL的6 mmol/L的過氧化氫溶液，混合均勻，靜止10 min后，加入100 μL的6 mmol/L的水楊酸溶液，混勻，靜止30 min后，在510 nm波長處測定吸光度Ai。重復上述步驟，以蒸餾水代替水楊酸再次在510 nm波長處測定吸光度Aj，用蒸餾水代替樣品溶液在510 nm波長下測得的吸光度A0，則待測液對羥自由基清除率的計算為公式（5）：

2 結果與分析

2.1 AB-8大孔樹脂動態吸附泄漏曲線

圖1 大孔樹脂動態吸附泄漏曲線Fig. 1 Dynamic adsorption leakage curve of macroporous resin

當上樣條件一定時，上樣液流過樹脂，黃酮類化合物會被樹脂吸附，經過一定時間后，黃酮類化合物在樹脂與上樣液中分配達到平衡，即溶液中的黃酮類化合物不斷被樹脂吸附，同時吸附在樹脂上的黃酮類化合物又不斷脫附，當吸附速率等于脫附速率時，出現泄漏現象，由圖1可知，流出液體積為50 mL時，達到動態平衡，即出現泄漏現象。但在吸附樹脂吸附過程中，一般認為泄漏點為流出溶液中黃酮類化合物濃度為原上樣濃度的十分之一時對應的流出液體積[29]，即圖1中流出液中黃酮類化合物質量濃度為0.15 mg/mL時對應的流出液體積70 mL為該泄漏曲線的泄漏點。從圖1可以看出，上樣液體積很小時，樹脂對黃酮類化合物的吸附很好，沒有泄漏現象，當流出液為70 mL，黃酮類化合物開始泄漏，流出液體積達到130 mL時，流出的綠豆皮黃酮類化合物質量濃度與原上樣液中綠豆皮黃酮類化合物質量濃度接近，此時AB-8大孔樹脂對綠豆皮黃酮類化合物的吸附已達到飽和狀態，因此可以確定，在此上樣條件下，AB-8大孔樹脂分離純化綠豆皮黃酮類化合物最大上樣量不能超過130 mL。

2.2 上樣條件的優化結果

2.2.1 單因素試驗結果

2.2.1.1 上樣液質量濃度對黃酮類化合物吸附量的影響

圖2 上樣液質量濃度對黃酮類化合物吸附量的影響Fig. 2 Effect of sample concentration on adsorption of flavonoids

由圖2可以看出，隨著上樣液質量濃度的增加，A-8大孔樹脂對黃酮類化合物的吸附量先增加后減小，當上樣液質量濃度在1.5 mg/mL時，此時有最大吸附量19.14 mg/g。上樣液質量濃度未達到1.5 mg/mL時，大孔吸附樹脂上有足夠的吸附空間吸附溶液中的黃酮類化合物，所以隨著上樣液質量濃度的增加，樹脂對黃酮類化合物的吸附量也增加。但上樣液質量濃度超過1.5 mg/mL時，溶液中的雜質隨之增多，也被樹脂所吸附，侵占了黃酮類化合物的吸附空間，所以，在上樣液質量濃度大于1.5 mg/mL時，隨著上樣液質量濃度的增加，樹脂對黃酮類化合物的吸附量減少。

2.2.1.2 上樣液pH值對黃酮類化合物吸附量的影響

由圖3可以看出，隨著上樣液pH值的增大，AB-8大孔樹脂對黃酮類化合物的吸附量先增加后減小，當pH值在5.0時，此時有最大吸附量為20.67 mg/g。這是因為當上樣液pH值在5.0時，溶液中黃酮類化合物存在形式為分子形式，有利于大孔樹脂的吸附，pH值過高或過低，黃酮類化合物存在形式都會改變，或形成鹽或分子中羥基上的H＋離去，以負離子形式存在，2 種存在方式都不利于AB-8大孔樹脂的吸附。

圖3 pH值對黃酮類化合物吸附量的影響Fig. 3 Effect of pH on adsorption of flavonoids

2.2.1.3 上樣流速對黃酮類化合物吸附量的影響

圖4 上樣流速對黃酮類化合物吸附量的影響Fig. 4 Effect of sample flow rate on adsorption of flavonoids

由圖4可以看出，隨著上樣流速的增大，AB-8大孔樹脂對黃酮類化合物的吸附量逐漸減小，也就是隨著上樣流速的增加，層析柱流出液中含有的黃酮類化合物越來越多。這是因為，上樣流速快，綠豆皮中黃酮類化合物接觸大孔樹脂時間短，黃酮類化合物還沒來得及被吸附就流出柱體，所以呈現出上樣流速快，大孔樹脂對綠豆皮黃酮類化合物吸附量小，上樣流速慢，大孔樹脂對綠豆皮黃酮類化合物吸附量反而增高的現象。然而，在實際操作中，上樣流速過慢會影響實驗周期，所以選擇上樣流速1.0 mL/min為宜。

2.2.2 正交試驗結果

由表2可以看出，AB-8大孔樹脂純化綠豆皮黃酮最優上樣條件為A2B2C3，3 個因素對綠豆皮黃酮類化合物的吸附量影響程度依次為A＞C＞B，在正交表中最佳上樣條件下對綠豆皮黃酮類化合物吸附量為21.59 mg/g，和理論上樣條件A2B2C2不符。經過驗證實驗，在理論上樣條件下得到綠豆皮黃酮類化合物吸附量為22.37 mg/g，大于實際優化值，所以AB-8大孔樹脂純化綠豆皮黃酮最優上樣條件為A2B2C2，即上樣液質量濃度1.5 mg/mL、pH 5.0、上樣流速1.0 mL/min。

表2 L9（34）正交試驗設計與結果Table 2 L9 (34) Orthogonal array design with response variable

2.3 洗脫條件的優化結果

2.3.1 洗脫劑體積分數及洗脫劑用量的確定

圖5 洗脫劑體積分數及洗脫劑用量對黃酮解吸率的影響Fig. 5 Effect of eluent concentration and dosage on desorption of flavonoids

由圖5可知，隨著洗脫劑乙醇體積分數的增加，洗脫劑對綠豆皮黃酮類化合物的解吸能力增大，即表現為乙醇體積分數越高，黃酮類化合物的解吸率越大。這是因為乙醇體積分數越高，洗脫劑的極性越弱，而弱極性的AB-8樹脂吸附的極性較小的黃酮類化合物很容易被弱極性的洗脫劑洗脫下來，所以洗脫劑乙醇的體積分數越高，對黃酮類化合物的解吸能力越強，解吸率越高，但考慮到乙醇體積分數越大，除了有黃酮類化合物被洗脫出來，雜質也會隨之洗脫下來，綜合考慮，選擇體積分數為70%的乙醇溶液作洗脫劑為宜。另外，從圖5還可看出，選用70%乙醇溶液為洗脫劑時，當洗脫劑用量達到225 mL（約5 倍樹脂柱體積），解吸已經達到平衡，增大洗脫體積，解吸率變化不明顯。

2.3.2 洗脫流速的確定

由圖6可知，隨著洗脫流速的增加，AB-8大孔樹脂對綠豆皮黃酮類化合物的解吸率逐漸較小，洗脫效果明顯減弱。這是因為洗脫流速大，洗脫劑與樹脂接觸時間過短，黃酮類化合物還沒來得及被溶入洗脫液中，洗脫劑就流出了樹脂。所以洗脫流速越大，解吸效果越差。但考慮洗脫流速過小，影響實驗進度，所以洗脫流速選擇2.0 mL/min為宜。

圖6 洗脫流速對黃酮類化合物解吸率的影響Fig. 6 Effect of eluent flow rate on desorption of flavonoids

2.3.3 動態洗脫曲線

圖7 動態洗脫曲線Fig. 7 Dynamic elution curve

由圖7可知，用體積分數為70%的乙醇作為洗脫劑，以2.0 mL/min的速率進行洗脫，當洗脫劑體積為20 mL時，即有黃酮類化合物被洗脫下來，在洗脫體積為220 mL時，黃酮類化合物質量濃度出現最高峰，在洗脫劑體積達到400 mL時，黃酮類化合物基本全部被洗脫下來。洗脫曲線出峰早，無明顯拖尾現象，洗脫良好。

2.3.4 純化后綠豆皮黃酮純度的測定

按AB-8大孔樹脂的初步分離純化綠豆皮黃酮工藝進行3 次重復實驗，經計算綠豆皮黃酮純度分別為59.91%、63.04%、64.19%，取其平均值為62.38%，相對標準偏差為3.55%。

2.4 AB-8大孔樹脂初步純化后結構鑒定

2.4.1 紫外-可見光譜分析

圖8 AB-8大孔樹脂層析后水洗（A）和醇洗（B）餾分的紫外-可見光掃描圖Fig. 8 Ultraviolet-visible absorption spectra of washing (A) and ethanol eluted (B) fractions

由圖8A可知，蒸餾水沖洗部分僅在250～300 nm間出現了一個峰，即峰I，不具備黃酮化合物的出峰位置，所以蒸餾水沖洗部分不含有黃酮類化合物或者含有黃酮類化合物甚微。由圖8B可知，70%醇洗部分則在250～280 nm和300～400 nm間分別出現了黃酮類化合物的2 個明顯的特征峰，峰I和峰II，所以70%乙醇洗脫液中含有豐富的黃酮類化合物，將AB-8大孔樹脂初步純化后的樣液經旋轉蒸發、冷凍干燥后，計算得到黃酮類化合物的純度為62.38%。

2.4.2 FTIR分析

圖9 AB-8大孔樹脂初步純化后FTIR圖Fig. 9 FTIR spectrum of purified flavonoids

如圖9所示，經過AB-8大孔樹脂初步純化的綠豆皮黃酮經紅外光譜掃描具備了黃酮類物質應具有的特征官能團：波數3 392.72 cm－1是由于羥基的存在，分子間和分子內部相互作用使羥基締合而形成較寬大的強吸收峰；波數2 927.81 cm－1是亞甲基的C—H伸縮振動峰；波數1 654.95 cm－1是由于芳酮羰基C＝O伸縮振動所引起的特征吸收峰；波數1 610.49、1 575.03 cm－1和1 508.67 cm－1為苯環中的C＝C振動特征吸收峰；波數1 328.34 cm－1為羥基彎曲振動特征吸收峰；波數1 200～1 050 cm－1的吸收峰為酚羥基的C—O特征峰；波數831.95 cm－1為芳香環中的＝C—H振動特征吸收峰。

2.4.3 SEM分析

前期工作已經證實了綠豆皮黃酮類化合物主要含有牡荊素和異牡荊素2 種黃酮單體[30]。從圖10可以看出，超聲波-酶法提取出來的黃酮粗提物中能看到片狀和粉粒狀顆粒被暴露出來（圖10A），但仍有大部分這樣的顆粒被包裹著，黏在一起。經過AB-8大孔樹脂純化后的純化物經SEM可以看出，被包裹的片狀和粉粒狀顆粒大部分被釋放出來（圖10B）。這可能是導致純化后黃酮類化合物純度增高的原因。

圖10 粗提物和AB-8大孔樹脂初步純化物SEM圖Fig. 10 SEM picture of crude and purified extract

2.5 抗氧化能力測定結果

2.5.1 對DPPH自由基清除能力的比較

圖11 DPPH自由基清除能力的比較Fig. 11 Comparison of DPPH free radical scavenging ability between crude and purified flavonoids

由圖11可以看出，綠豆皮黃酮在純化前后對DPPH自由基均具有一定的清除能力，且均隨著質量濃度的增大而清除能力增強，雖然相同質量濃度下純化前后的綠豆皮黃酮對DPPH自由基的清除能力都低于VC的清除能力，但綠豆皮黃酮純化物更接近VC的清除能力。綠豆皮黃酮純化物和VC對DPPH自由基清除的半抑制質量濃度IC50分別為57.64 μg/mL和28.69 μg/mL，而黃酮粗提物對DPPH自由基清除的IC50為108.74 μg/mL，綠豆皮黃酮純化物同VC一樣具有很好的抗氧化能力。

2.5.2 對羥自由基清除能力的比較

從圖12可以看出，隨著質量濃度的增加，綠豆皮黃酮在純化前后同VC一樣對羥自由基清除能力逐漸增強，但在相同質量濃度下對羥自由基的清除能力表現為VC最強，綠豆皮黃酮純化物次之，綠豆皮黃酮粗提物最弱。VC、綠豆皮黃酮純化物、綠豆皮黃酮粗提物對羥自由基清除的IC50分別為70.04、81.19 μg/mL和109.83 μg/mL，綠豆皮黃酮純化物同VC一樣具有較強的抗氧化能力。

圖12 對羥自由基清除能力的比較Fig. 12 Comparison of hydroxyl free radical scavenging ability between crude and purified flavonoids

3 結 論

采用AB-8大孔樹脂純化綠豆皮黃酮，考察各因素對吸附解吸性能的影響，得到分離純化工藝條件為上樣液質量濃度1.5 mg/mL、上樣液pH5.0、上樣流速1.0 mL/min；洗脫劑乙醇體積分數70%、洗脫劑用量225 mL、洗脫流速2.0 mL/min，在此條件下分離純化，綠豆皮黃酮純度由27.95%提高到62.38%。該方法操作簡單，成本低，適合工業化生產。純化后的綠豆皮黃酮通過紫外-可見分光光度計光譜掃描分別在250～280 nm和300～400 nm波長處出現2 個黃酮類化合物特征峰帶，滿足黃酮類化合物出峰特征，證明黃酮類化合物的存在。利用FTIR光譜掃描，在波數3 392.72、2 927.81、1 654.95、1 610.49、1 575.03、1 508.67、1 328.34、831.95 cm－1以及1 200～1 050 cm－1之間出現了黃酮類化合物特征官能團的吸收峰。SEM對純化前后黃酮類物質進行微觀分析，得出片狀和粉粒狀顆粒在經過AB-8大孔樹脂純化后數量明顯增多，這可能是導致綠豆皮黃酮類化合物在純化后純度增高的原因。抗氧化實驗表明，純化后的綠豆皮黃酮和VC一樣對DPPH自由基和羥自由基都有很強的清除能力，清除效果強于純化前的綠豆皮黃酮粗提物，純化后的綠豆皮黃酮抗氧化能力大大增強，為進一步開發和利用綠豆皮資源提供依據。

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