杏仁核在腦梗死合并心律失常中的作用

賈淑偉 王玲 焦潤生

[摘要] 目的 探討杏仁核在腦梗死合并心律失常中的作用及可能機制。 方法 為觀察腦梗死后杏仁核神經元活動的變化，將48只大鼠隨機平均分為假手術組，腦梗死后30 min、1 h、2 h、4 h和8 h組。為觀察谷氨酸在腦梗死誘發心律失常中的作用，另取40只大鼠隨機平均分為空白對照組、生理鹽水組、L-谷氨酸組、MK-801預處理后側腦室注射L-谷氨酸組和MK-801預處理后再進行中動脈栓塞（MCAO）組。通過大鼠大腦MCAO建立腦梗死模型，用生物信號采集系統采集心電圖，用Fos蛋白作為神經元激活標志物。 結果 假手術組心律失常的發生率為0，腦梗死組心律失常的發生率為78.75%，明顯高于假手術組（P < 0.01），且在心律失常發生的相應時間點杏仁核Fos蛋白表達明顯增加（P < 0.01）。空白對照組和生理鹽水組心律失常的發生率均為0，L-谷氨酸組心律失常的發生率為87.5%，明顯高于空白對照組（P < 0.01），且L-谷氨酸組杏仁核Fos蛋白表達明顯增高（P < 0.05）。MK-801預處理后MCAO組和MK-801預處理后側腦室注射L-谷氨酸組心律失常的發生率均為0，且杏仁核Fos蛋白表達均無明顯變化（P > 0.05）。 結論 腦梗死后杏仁核活動的增強可能參與了腦梗死后心律失常的發生發展，且此作用可能由谷氨酸激活門冬氨酸受體所介導。

[關鍵詞] 杏仁核；腦梗死；心律失常；谷氨酸；門冬氨酸受體

[中圖分類號] R33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）03（a）-0020-04

[Abstract] Objective To investigate the association between ischemic stroke-induced arrhythmia and the activity of amygdala and the possible mechanism. Methods Forty-eight rats were randomly and equally divided into the following groups： sham-operated group， 30 min， 1 h， 2 h， 4 h， and 8 h after ischemic stroke groups， and the changes of the activity of amygdala neurons in ischemic stroke rats were observed. Forty rats were randomly and equally divided into the following groups： blank control group， saline group， L-glutamate group， MK-801 before L-glutamate and MK-801 preceding making model group， and the effects of glutamate on arrhythmia induced by ischemic stroke were observed. The experimental cerebral ischemic animal model was established by occluding the right middle cerebral artery （MCAO）. The electrocardiography was recorded by a biological signal collecting and processing system. Fos protein was used as an objective indicator to illustrate the functional state of neurons. Results The incidence of arrhythmia in model group was 0， and the sham-operated group was 78.75%， the incidence of arrhythmia in the sham-operated group was significantly higher than that in model group （P < 0.01）， and the expression of Fos protein in the amygdala was also increased significantly during the arrhythmia （P < 0.01）. The incidence of arrhythmia in blank control group and saline group was 0， L-glutamate group was 87.5%， which was significantly higher than blank control group （P < 0.01）， and the expression of Fos protein in the amygdala of the L-glutamate group was also increased significantly （P < 0.05）. The incidence of arrhythmia in both MK-801 preceding making model group and MK-801 preceding L-glutamate group was 0， and the expression of Fos protein had no obvious change （P > 0.05）. Conclusion It is concluded that activation of the amygdala in ischemic stroke rats is likely mediated by glutamate via activation of N-methyl-D-aspartic acid receptors， which causes arrhythmias.

[Key words] Amygdala； Ischemic stroke； Arrhythmia； Glutamate； NMDA receptor

腦梗死合并心律失常是腦梗死猝死的主要原因之一[1]，其起病急、變化快的特點不能用腦疝解釋[2]，且許多腦梗死合并心律失常的患者不存在原發心臟病史[3]，提示腦梗死后心律失常的發生源于中樞神經系統的活動異常。杏仁核是前腦內參與自主神經系統和心血管功能活動的重要整合中樞之一[4]。杏仁核受損時，心電圖可發生明顯改變[5]，通過刺激杏仁核可建立交感源性心律失常動物模型[6]。是否腦梗死后心律失常的發生與杏仁核的活動增強有關？本研究觀察了腦梗死后大鼠杏仁核神經元活動的改變，并探討了其與腦梗死后心律失常發生的相關性及可能的谷氨酸能機制，以期揭示腦梗死合并心律失常的部分中樞機制。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

雄性健康Wistar大鼠，體重210～250 g，購自哈爾濱醫科大學實驗動物學部。

1.2 藥物與試劑

TTC購自中國醫藥上海化學試劑公司。GAPDH單克隆抗體購自碧云天生物技術研究所。c-fos多克隆抗體（sc-52，Santa Cruz）購自中杉金橋公司。AP標記馬抗小鼠二抗（zd-2310）購自中杉金橋公司。AP標記的山羊抗兔二抗（zb-2308）購自中杉金橋公司。

1.3 儀器

RM6240B生物信號采集系統，中國成都泰盟；大鼠腦立體定位儀SN-3，日本Narishige；石蠟切片機RM2016，德國徠卡；凝膠成像系統，美國Alpha。

1.4 實驗分組

48只大鼠隨機分為假手術組，腦梗死后30 min、1 h、2 h、4 h和8 h組，每組8只，以觀察腦梗死后杏仁核神經元活動的變化。假手術組在術后2 h取材，腦梗死各時間組在梗死后的相應時間點取材。另取40只大鼠隨機分為空白對照組、生理鹽水組（10 μL）、L-谷氨酸組（0.5 μmol，10 μL）、MK-801（4 nmol，10 μL）預處理后再側腦室注射L-谷氨酸組和MK-801預處理后再MCAO組，每組8只，分別在側腦室注射后或術后30 min取材，以觀察腦梗死誘發心律失常中谷氨酸的作用。每項實驗前大鼠均監測心電20 min，心電圖正常者用于實驗。

1.5 腦梗死動物模型的制備和鑒定

腦梗死動物模型的制備方法同前期發表文章[7-9]，基本過程為：水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，頸部正中縱行切口，游離右側頸總、頸內和頸外動脈，結扎頸外動脈，暫時夾閉頸內動脈，頸總動脈開一小口，將栓線向頭側插入，經頸內動脈進入大腦中動脈，進線長度（17.5±0.5）mm，形成大腦中動脈栓塞。假手術組栓線插至大腦中動脈起始處撤回，余同模型組。模型的鑒定采用TTC染色和神經功能學評分[10-11]，TTC染色梗死區明顯且神經功能學評分大于2分者造模成功。

1.6 Western Blot檢測

腦組織入組織裂解液研磨，勻漿液4℃ 1000 r/min離心15 min，取上清，測蛋白濃度，上樣，電泳分離（10%聚丙烯酰胺凝膠），轉膜（聚偏二氟乙烯膜），37℃封閉（3%牛血清白蛋白）1 h，洗膜，加一抗（1∶500）4℃孵育過夜，洗膜，加二抗（1∶1000）孵育1 h，洗膜，BCIP/NBT顯色。GAPDH作內參，結果用Alphaview 3.1.1.0軟件分析。

1.7 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（LSD-t法），兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠大腦中動脈栓塞后心電圖變化

假手術組心律失常發生率為0，腦梗死組心律失常的發生率為78.75%，明顯高于假手術組（P < 0.01），且MCAO后大鼠會出現2次心律失常，分別在MCAO后30 min和4 h左右。空白對照組和生理鹽水組心律失常發生率均為0，L-谷氨酸組心律失常發生率為87.5%，明顯高于空白對照組（P < 0.01）。MK-801預處理20 min心律失常發生率為0，MK-801預處理20 min后再側腦室注射L-谷氨酸組或MCAO心律失常的發生率均為0。

2.2 大鼠大腦中動脈栓塞后杏仁核活動的改變

與假手術組比較，大鼠大腦中動脈栓塞后杏仁核神經元Fos蛋白的表達在造模后30 min和4 h明顯增加，差異有統計學意義（P < 0.01），與MCAO后心律失常發生時間點相對應。見圖1。

2.3 大鼠大腦中動脈栓塞后杏仁核活動改變的谷氨酸能機制

與空白對照組比較，生理鹽水組杏仁核神經元Fos蛋白表達的變化差異無統計學意義（P > 0.05），L-谷氨酸組杏仁核神經元Fos蛋白表達明顯增加（P < 0.05），MK-801預處理后給予L-谷氨酸或MCAO后Fos蛋白表達無明顯變化（P > 0.05）。見圖2。

3 討論

腦梗死合并心律失常是腦梗死猝死的主要原因之一，嚴重威脅著人類的健康。本研究發現，MCAO可誘發心律失常的發生，與臨床報道一致[1]，但MCAO后心律失常的發生率偏高于臨床，可能與實驗動物模型腦缺血程度相對均一有關。越來越多的臨床和實驗證明，心律失常的發生除與心臟自身的病變有關外，還與中樞神經系統的功能狀態密切相關。腦梗死可破壞中樞神經系統的完整性，進而導致自主神經系統活動異常[12]，特別是交感神經過度激活，與致命性心律失常的發生密切相關[13]。杏仁核是前腦內參與自主神經系統和心血管功能活動整合中樞之一[4]，杏仁核受損時，心電圖會發生明顯改變[5]，通過刺激杏仁核可建立交感源性心律失常動物模型[6]。