優(yōu)化心肌能量代謝對SMVT大鼠腸道組織中HIF—1與VEGF表達的影響

虞向陽　謝宗源　陳建立

[摘要] 目的 探討優(yōu)化心肌能量代謝對腸系膜上靜脈血栓形成大鼠腸道組織中低氧誘導因子-1（HIF-1）與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達的影響。 方法 將45只健康成年SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組及治療組，每組各15只。模型組動物進行造模試驗，經(jīng)皮下注射生理鹽水0.2 mL/100 g后常規(guī)飼養(yǎng)；治療組動物經(jīng)造模后，經(jīng)尾靜脈注射曲美他嗪（10 mg/kg）；對照組則僅打開腹腔，不阻斷血運，后經(jīng)皮下注射生理鹽水0.2 mL/100 g。每組均間隔12 h重復給予藥物干預，直至術后72 h。觀察并比較三組大鼠一般狀態(tài)、腹腔情況、病理情況及HIF-1、VEGF、丙二醛（MDA）、肌酸激酶（CK）和三磷酸腺苷（ATP）水平。結果 對照組一般狀況、腹腔情況、腸道組織病理學觀察均顯示正常，模型組腸道壞死，部分區(qū)域伴穿孔，治療組意識、活動、腸壁血運基本恢復正常，無瘀血水腫及壞死脫落。與對照組比較，模型組HIF-1、VEGF、MDA、CK升高明顯，ATP降低明顯；與模型組比較，治療組HIF-1、VEGF、MDA、CK降低明顯，ATP升高明顯，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。 結論 優(yōu)化能量代謝劑曲美他嗪可清除自由基對心肌細胞的損害，明顯降低VEGF、HIF-1水平，改善動物腸道上靜脈血栓狀況，效果好。

[關鍵詞] 優(yōu)化心肌能量代謝；腸系膜上靜脈血栓形成；低氧誘導因子-1；血管內(nèi)皮生長因子；三磷酸腺苷

[中圖分類號] R572.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）03（c）-0013-05

[Abstract] Objective To study the effect of optimized myocardial energy metabolism on the expression of hypoxic induction factor-1 （HIF-1） and vascular endothelial growth factor （VEGF） in rats with superior mesenteric venous thrombosis. Methods Forty-five healthy adult SD rats were divided into control group， model group and treatment group by random number table. The model group animals were tested for the model， which were fed after subcutaneous injection of 0.2 mL/100 g of physiological saline solution. After the animals were formed， the tail vein was injected with Trimetazidine （10 mg/kg） in the treatment group. The control group was only opened the abdominal cavity， but was not block the blood transport， then injected the physiological saline with 0.2 mL/100 g. Each group was given a 12 h interval for drug intervention until 72 h after surgery. General state， abdominal cavity condition and pathological condition were observed， HIF-1， VEGF and malondialdehyde （MDA）， creatine kinase （CK）， and adenosine triphosphate （ATP） levels were determined. Results The general situation， peritoneal condition and intestinal histopathological observation of control group were normal， while intestinal of the model group was necrosis， the part region was perforation， consciousness and activity of treatment group， blood transport of intestinal was basically normal， and there was no bleeding edema and no necrosis. Compared with the control group， the levels of HIF-1， VEGF， MDA and CK in the model group were significantly higher， ATP level was decreased， with statistically significant difference （P < 0.05）. Compared with the model group， the levels of HIF-1， VEGF， MDA and CK in the treatment group were decreased significantly， ATP level was higher， with statistically significant difference （P < 0.05）. Conclusion Optimize energy metabolizer Trimetazidine can remove free radical damage to myocardial cells， and can significantly reduce VEGF and hif-1 levels， improve the condition of venous thrombosis in animal intestines with good effect.

[Key words] Optimized myocardial energy metabolism； Superior mesenteric venous thrombosis； Hypoxia-Inducible Factor-1； Vascular endothelial growth factor； Adenosine triphosphate

腸系膜上靜脈血栓形成（superior mesenteric venous thrombosis，SMVT）作為MVT累及最為常見的一種血管源性急腹癥[1-2]，近年來隨著多排螺旋CT技術的快速發(fā)展，其檢出率明顯提高，但廣大醫(yī)務工作者對SMVT仍還存在一些模糊認識，認知較局限，對其治療仍主要根據(jù)病情癥狀體征的嚴重程度而定，但治療效果卻不盡如人意。

能量代謝是近年來研究的熱點，優(yōu)化能量代謝劑曲美他嗪（Trimetazidine，TMZ）作為哌嗪類衍生物的一種，在改善缺血、缺氧心肌細胞的能量代謝方面作用顯著，可對抗心肌缺血[3-8]。目前關于TMZ在冠心病治療中的應用較多，但關于其在SMVT中的應用國內(nèi)外相關報道極少。再加之發(fā)病率低，合適動物模型的建及其有效的治療方法的探討對于該疾病的研究較為重要。為此，本研究采用結扎法建立SMVT大鼠模型并采用TMZ進行治療，以探討優(yōu)化心肌能量代謝對SMVT的干預效果，為進一步研究該病提供基礎依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康成年雄性SD大鼠，由華北理工大學動物實驗中心提供，動物合格證號：SYXK（冀）2016-0040，體重220～240 g，適應性飼養(yǎng)5 d，自由飲水飲食。45只大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組及治療組，每組各15只。本研究所用動物均經(jīng)華北理工大學動物倫理委員會審核并批準。

1.2儀器及試藥

BX53熒光顯微鏡（奧林巴斯OLYMPUS生產(chǎn)），小動物麻醉機及酶標儀（美國matrx），七氟醚（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司），低氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate，ATP）試劑盒均購自南京建成公司。

1.3 方法

模型組動物進行造模試驗，經(jīng)皮下注射生理鹽水0.2 mL/100 g后常規(guī)飼養(yǎng)；治療組動物經(jīng)造模后，經(jīng)尾靜脈注射TMZ（10 mg/kg）；對照組則僅打開腹腔，不阻斷血運，后經(jīng)皮下注射生理鹽水0.2 mL/100 g。每組均間隔12 h重復給予藥物干預，直至術后72 h 。

1.4 建立SMVT的動物模型

實驗前大鼠禁食禁水12 h，2%七氟醚吸入麻醉，取其仰臥位，并固定于手術臺，術區(qū)備皮，消毒鋪巾，在大鼠下腹部做一長2.5 cm的正中切口，找到盲腸，提出距回盲部5 cm處的小腸，充分暴露腸系膜。即用7-0無損傷尼龍線結扎近端小腸內(nèi)側緣4 cm處膜靜脈一級分支及兩端弓狀靜脈，腸道充血且為暗紅色為造模成功的標志。觀察臟器有無損傷或出血，術畢以3-0絲線逐層關閉腹腔。術中注意保護暴露的腸管。實驗操作完畢，將動物單獨放于保溫箱中待蘇醒，術日禁食禁水，10%葡萄糖注射液皮下注射5 mL，術后第2天正常飲食。

1.5觀察指標

一般狀態(tài)及腹腔情況觀察：一般狀態(tài)主要為活動、大小便情況。術后12、24、72 h再次開腹探查，觀察腸道有無粘連，有無側支血管形成，有無腸道瘀血及壞死發(fā)生，以及腸道蠕動等情況。

病理情況觀察：術后12、24、72 h 2%七氟醚吸入麻醉，二次開腹，中央切斷受累腸管，并用生理鹽水沖洗干凈，清除腸內(nèi)物，選擇自切斷處一端切取腸管1 cm，4%多聚甲醛溶液中浸泡固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度4 μm，HE染色，熒光顯微鏡下觀察病理變化。

HIF-1、VEGF及MDA、CK、ATP水平的測定：于術后72 h抽取尾靜脈血5 mL，于潔凈玻璃管內(nèi)離心，3000 r/min（r=10 cm），20 min后取上清液，采用ELISA法測定血清HIF-1、VEGF及MDA、CK、ATP水平，具體操作步驟參照試劑盒內(nèi)說明書。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0對所得實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 各組動物的一般狀態(tài)觀察

對照組正常生長，活動自如，神態(tài)精神，皮毛光亮，飲食及大小便正常；模型組術后8 h出現(xiàn)便血，并逐漸加重，1只因栓塞嚴重而死亡；治療組大鼠術后2 h稍萎靡，但意識逐步恢復，隨著時間延長，活動逐步趨于正常。

2.2 腹腔情況觀察

對照組腸道組織均正常表現(xiàn)，無水腫、無血性腹水，腸蠕動完全正常。模型組：術后12 h大鼠腸系膜結扎區(qū)域腸道系膜發(fā)現(xiàn)暗紅色瘀血，腸壁水腫加重，血性腹水不斷增多；術后24 h腸道損害情況繼續(xù)加重，暗紅色腹水，腸壁高度水腫，腸蠕動減弱，腸壁間嚴重粘連；術后72 h腹水暗紅色加深，腸道明顯壞死，部分腸壁已出現(xiàn)穿孔。治療組：術后12 h腸壁瘀血水腫減輕，腸道輕度痙攣，血性腹水減少；術后24 h腸壁及腸系膜水腫緩解明顯，腹水量顯著減少，顏色淡紅色，腹腔腸管無粘連；術后72 h腸壁血運基本恢復正常，未發(fā)現(xiàn)水腫瘀血，腸蠕動正常。見圖1。

2.3 腸道組織病理學觀察

對照組：術后腸壁全層及腸系膜均正常，無腸道平滑肌壞死及腸道黏膜壞死脫落。模型組：術后12 h腸壁及腸系膜瘀血擴張，表現(xiàn)加重，腸道黏膜及腸道平滑肌大量脫落壞死；術后24 h腸道平滑肌壞死區(qū)域擴大明顯；術后72 h腸道平滑肌全層壞死，部分區(qū)域出現(xiàn)穿孔。治療組：術后12 h術后腸壁及腸系膜廣泛瘀血表現(xiàn)減輕，腸道黏膜壞死脫落有所緩解，部分區(qū)域壞死腸道平滑肌改善；術后24 h腸道黏膜未出現(xiàn)壞死脫落，腸道平滑肌壞死范圍逐步縮小；術后72 h腸道及腸系膜瘀血改善，腸道黏膜及腸道平滑肌未再發(fā)生壞死脫落。見圖2。

2.4 各組大鼠腸道中HIF-1及VEGF表達比較

三組間HIF-1及VEGF比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。組間兩兩比較：與對照組比較，模型組HIF-1及VEGF升高明顯；與模型組比較，治療組HIF-1及VEGF降低明顯，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.5 各組大鼠腸道組織中MDA、CK、ATP水平比較

三組間MDA 、CK、ATP水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。組間兩兩比較：與對照組比較，模型組MDA、CK升高明顯，ATP降低明顯；與模型組比較，治療組MDA、CK降低明顯，ATP升高明顯，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。表2。

3 討論

SMVT的臨床表現(xiàn)一般是非特異性，易導致誤診。對于腹水并伴有血栓疾病史或家族史的患者，臨床上要高度懷疑SMVT，SMVT腹痛的程度與體征存在不相符的情況[9-11]。一般而言，SMVT腹痛常表現(xiàn)為臍周的絞痛，并存在惡心嘔吐、腹瀉等癥狀[12]，其次15%的患者存在嘔血、便血，50%的患者存在便潛血[13-16]，嚴重者常會危及生命。

心肌能量代謝是影響患者心功能的重要因素。隨著臨床醫(yī)師對SMVT的認識逐漸深入，其治療方法也在不斷發(fā)展，但其在SMVT中的應用研究尚少。TMZ作為調(diào)節(jié)心肌能量代謝藥物，通過降低游離脂肪酸的氧化速率，減輕線粒體內(nèi)鈣聚積，使心肌細胞內(nèi)氧自由基產(chǎn)生減少，進而保護線粒體、抗氧化應激等來保護心肌，維持ATP的產(chǎn)生和缺血心肌細胞的能量代謝及收縮功能[17-19]。具體過程為：可抑制線粒體內(nèi)長鏈3-酮酰輔酶A硫解酶來減少游離脂肪酸β-氧化，促進葡萄糖的有氧氧化，降低心肌對脂肪酸的利用程度，維持ATP的水平，進而達到優(yōu)化心肌能量代謝的目的。其還能夠利用細胞內(nèi)部分代謝相關酶，降低乳酸脫氫酶的釋放，使得細胞內(nèi)的乳酸堆積減少，緩解細胞內(nèi)酸中毒，同時抑制血小板聚集及心肌組織中性粒細胞浸潤，降低心肌梗死的發(fā)生。另外，TMZ還通過保護線粒體的正常功能，增加心肌細胞的ATP含量；減少氧化應激過程中心肌線粒體鈣超負荷。本研究結果提示與上述論述一致，可見TMZ具有清除自由基對心肌細胞損害的作用，是一種治療SMVT效果較好的優(yōu)化能量代謝劑。

本實驗還顯示，模型動物術后24 h腸管間粘連嚴重，大量側支血管出現(xiàn)，72 h最為嚴重，且有血性腹水形成，暗紅色血，病理結果與上述分析一致，提示造模成功。治療組腸道瘀血情況在12 h有所緩解，24 h逐漸恢復，72 h趨于轉歸，可見阻斷腸道內(nèi)徑6 cm范圍腸系膜靜脈一級分支及邊緣靜脈，在優(yōu)化心肌能量代謝后改善，提示小范圍SMVT腸道損害經(jīng)優(yōu)化心肌能量代謝可以恢復。

VEGF作為多功能血管通透因子的一種，可于全身血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮作用，加速內(nèi)皮細胞的分裂、增以及遷移，并參與血管的新生[20]。其還能夠改善血管通透性、營養(yǎng)并保護神經(jīng)。HIF-1可參與細胞缺氧誘導的特異應答反應，在缺氧誘導的基因表達中發(fā)揮關鍵作用[21]。同時可增加VEGF及多種血管生成因子的表達，加速生理性和病理性微血管的生成，由于新生血管為非功能性血管，當其通透性增加，斑塊內(nèi)發(fā)生出血或破裂，引發(fā)血栓。本研究顯示，模型動物VEGF和HIF-1的表達明顯高于對照組，治療組動物血清VEGF和HIF-1水平降低明顯，表明VEGF、HIF-1在SMVT動物血清中呈高表達；優(yōu)化心肌能量代謝可明顯改善動物腸道上靜脈血栓狀況。

綜上，優(yōu)化能量代謝劑TMZ通過降低SMVT動物血清MDA和CK含量，增加心肌中ATP含量來清除自由基對心肌細胞損害；同時可明顯改善動物腸道上靜脈血栓狀況，效果較好。

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（收稿日期：2017-12-25 本文編輯：李岳澤）