等毒性劑量芥子氣誘導大鼠肺損傷炎性因子和蛋白表達變化

于丹 鐘玉緒 李源 謝劍煒 祝筱姬

1濰坊醫學院研究生部（山東淮坊261053）；2軍事醫學研究院毒物藥物研究所，毒理學與抗毒藥物國家重點實驗室（北京 100850）；3解放軍第89醫院呼吸科（山東濰坊 261021）

芥子氣（sulfur mustard，SM）是一種能導致DNA烷化，蛋白修飾，細胞膜損傷的化學性毒劑［1-2］。SM可經呼吸道、皮膚、眼睛及消化道等不同途徑染毒，但不同途徑中毒的毒理學特點各異［3-6］。研究表明，不同途徑SM染毒的分子毒理學與其毒性作用的分子靶標和代謝差異密切相關。SM損傷的分子毒理機制主要涉及炎性反應、氧化應激、細胞凋亡、DNA損傷等，但其具體的分子機制迄今仍未明確［7］。肺是SM損傷的主要靶器官之一，一旦染毒將會導致高的致殘率和致死率［8-9］。前期研究發現，SM誘導大鼠急性肺損傷后，其血清炎性因子水平和肺泡間隔炎性細胞浸潤及肺泡支氣管灌洗液細胞和蛋白含量明顯增多［10-11］。然而，在SM等毒性劑量（1LD50）下，經兩種染毒途徑誘導急性肺損傷炎性反應是否存在差別，文獻未見報道。本文通過建立經腹腔和氣管途徑SM（1LD50）誘導大鼠急性肺損傷模型，比較2種模型血清炎性因子水平和肺泡間隔相關蛋白表達的差異性，并探討SM肺損傷的分子機制，為其藥物防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 白細胞介素-23（interleukine-23，IL-23）、γ-干擾素（interferon gamma-γ，INF-γ）、白細胞介素-4（interleukine-4，IL-4）Elisa試劑盒，由上海繪辛生物科技有限公司提供；細胞核因子-β1（nuclear transcription factor-β1，NF-κβ1）、細胞核因子-βp65（nuclear transcription factor-βp65，NF-κβp65）、細胞外信號調節激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）、c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38激活絲裂原活化蛋白酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）免疫組化試劑盒，由北京博奧森生物技術有限公司提供；Versa Max酶標儀，美國Molecular Devices公司；Image-Pro Plus 6.0病理細胞圖像分析系統，美國Media Cybernetics公司。

1.2 動物和實驗分組 健康雄性SD大鼠（SPF級，軍事醫學研究院實驗動物中心，合格證號：0015902）136只，體質量280～300 g，年齡15周。預實驗，經過霍恩氏法計算，腹腔途徑SM（0.96 LD50=8 mg/kg）和經氣管途徑SM（0.98 LD50=2 mg/kg）的半數致死量（median lethal dose，LD50），然后通過等毒性劑量SM（1LD50）染毒。將大鼠分為腹腔SM組（32只）、腹腔丙二醇組（32只）、氣管SM組（32只）、氣管丙二醇組（32只）、正常對照組（8只）。SM液（純度96%）臨用前用丙二醇稀釋至所需濃度。（1）氣管途徑染毒動物模型建立：實驗前氣管SM組和氣管丙二醇組皮下注射阿托品（0.05 mg/kg），30 min后腹腔內注射鹽酸氯胺酮（100 mg/kg）實施麻醉，氣管內注入稀釋的SM 0.1 mL（1LD50=2 mg/kg），氣管丙二醇組注入丙二醇0.1 mL。（2）腹腔途徑染毒動物模型建立：同氣管途徑方法實施麻醉。腹腔SM組大鼠腹腔內注入稀釋的SM 0.1 mL（1LD50=8 mg/kg），腹腔丙二醇組注入丙二醇0.1 mL。正常對照組不做任何處理。

1.3 ELISA法檢測血清炎性因子 將腹腔SM組、腹腔丙二醇組、氣管SM組、氣管丙二醇組、正常對照組不同時間段獲取的大鼠血2 mL，37℃水浴1 h，4 ℃ 過夜，血標本離心（223.6g，10 min），取上清液，分裝在無菌小瓶中，-80℃保存備用。采用Versa Max酶標儀，檢測血清IL-23、INF-γ、IL-4水平。所有流程嚴格按說明書進行操作。

1.4 免疫組化（SP法）染色 收集各組大鼠肺組織標本。石蠟切片，脫蠟，水化，枸櫞酸緩沖液抗原修復，PBS洗滌，3%雙氧水封閉，正常山羊血清封閉，滴加兔抗大鼠 NF-κβ1、NF-κβp65、ERK、JNK、p38MAPK單克隆抗體 20 μL/片，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，中性樹膠封片。PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照。采用Image-Pro Plus 6.0病理細胞圖像分析系統，選取測量參數，測定陽性率和強陽性率，每間隔1個高倍視野（400倍）選取1個視野進行觀察，每張切片至少觀察5個高倍視野，計算其肺泡間隔陽性細胞比率（=5個高倍視野的陽性細胞數／細胞總數×100%）并計算其平均值。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件，數據用xˉ±s表示，多組間用重復測量的多因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q法，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SM（1LD50）不同途徑對大鼠血清炎性因子的影響 腹腔和氣管SM組：血清IL-23、INF-γ水平24 h達高峰，然后逐漸下降；血清IL-4水平24 h達低峰，然后逐漸升高，72 h達高峰。5組不同時間血清炎性因子水平分別比較：（1）腹腔和氣管SM組不同時間點間血清IL-23、INF-γ、IL-4水平分別比較，差異有統計學意義；（2）腹腔SM組與其他4組分別比較，差異有統計學意義；（3）腹腔SM組與氣管SM組變化趨勢分別比較，差異有統計學意義；IL-23、INF-γ呈遞減趨勢，IL-4呈遞增趨勢（圖1 A～C）。

2.2 SM（1LD50）不同途徑對大鼠肺泡間隔NF-κβ1、NF-κβp65、ERK、JNK、p38MAPK蛋白表達的影響 腹腔和氣管SM組6 h肺泡間隔NF-κβ1、NF-κβp65、ERK、JNK、p38MAPK 蛋白陽性表達呈帶狀分布，24 h聚集成簇，48、72 h呈團簇狀。丙二醇和正常對照組呈零星分布（圖2）。5組不同時間肺泡間隔相關蛋白陽性表達率分別比較：（1）腹腔和氣管SM組不同時間點間的NF-κβ1、NF-κβp65、ERK、JNK、p38MAPK蛋白陽性表達率分別比較，差異有統計學意義；（2）腹腔SM組與其他4組蛋白陽性表達率分別比較，差異有統計學意義；（3）腹腔SM組與氣管SM組蛋白陽性表達率變化趨勢分別比較，差異有統計學意義，呈遞增趨勢。

3 討論

本研究發現，腹腔和氣管SM組各時間段血清INF-γ、IL-23水平24 h達最高峰，然后逐漸下降；血清IL-4水平24 h最低峰，48 h后呈現升高趨勢。本研究提示，在SM誘導肺損傷的急性期，促炎因子INF-γ和IL-23水平呈一過性升高，抗炎因子IL-4水平則一過性降低。可見，SM誘導大鼠血清炎性因子反應屬一種生理和（或）病理代償性反應，已達到促炎與抗炎反應新的平衡。文獻報道，這種反應可誘發氧化應激和細胞凋亡，導致SM對肺組織更進一步病理學改變［7，12］。SM誘導肺損傷急性期，促炎因子升高已形成共識［13-14］。在SM肺損傷慢性期，促炎因子可出現下調現象，這可能與免疫功能下降有關［15］。本研究還證實，作為SM的稀釋劑丙二醇，不能誘導大鼠血清炎性因子反應。筆者認為，炎性因子源于炎細胞釋放并能啟動炎性反應的重要因子，其分子水平的級聯效應是肺損傷的基礎。因此，炎性反應是SM肺損傷的分子機制之一，同樣如何抗炎則是SM誘導急性肺損傷防治的重要措施之一［16-17］。

圖1 大鼠血清IL-23、INF-γ、IL-4水平變化趨勢Fig.1 The trends in serum IL-23，INF-，IL-4 levels and the positive expression ratio of proteins-related in rats with SM（1LD50）

圖2 大鼠肺泡間隔NF-Kβ1、NF-Kβp65、ERK、JNK、p38MAPK蛋白陽性表達（× 400）Fig.2 The positive expression of NF-Kβ1，NF-Kβp65，ERK，JNK，p38MAPK proteins in the alveolar septum of rats with SM（1LD50）

本研究還發現，腹腔SM組大鼠肺組織各時間段肺泡間隔 NF-κβ1、NF-κβp65、ERK、JNK、p38MAPK蛋白陽性表達率顯著升高，提示腹腔SM組大鼠肺泡間隔炎性反應嚴重。這與我們前期研究的腹腔SM組大鼠肺泡間隔炎性細胞浸潤（淋巴細胞和巨噬細胞）增多結果一致［18］。本研究結果說明，肺泡間隔相關炎性蛋白表達與炎性細胞浸潤密切相關。肺泡間隔相關炎性蛋白表達的增加，揭示了SM誘導肺損傷炎性反應在分子水平的變化，且這些蛋白通道的激活對炎癥的發展起著關鍵性作用［19］。在正常情況下，胞漿中NF-κβ（包括 NF-κβ1和 NF-κβp65）與其抑制蛋白結合不具有活性。當機體受到刺激時，抑制蛋白被磷酸化并迅速降解，NF-κβ釋放和激活并轉移到細胞核內，結合特異性DNA位點，啟動相關基因轉錄［20］。ERK和JNK能應答多種細胞外刺激，參與調解細胞的生命過程，其信號功能失調與炎癥密切相關［21］。研究發現，SM誘導急性肺損傷可增加TGF-β1和Smad蛋白表達，結果提示有潛在肺纖維化形成的可能性［22］。同時，TGF-β1則可介導ERK通道，增強特定核轉錄因子NF-κβ活化，有利于促進膠原的合成［23］。ERK信號通道還可激活NF-κβ信號通道，兩者之間存在關聯性。因此，SM誘導急性肺損傷炎性反應可能與在轉錄水平ERK和NF-κβ細胞內信號蛋白激活有關［16］。另外，缺氧也可迅速激活ERK、JNK、p38MAPK蛋白，通過MAPK、ERK、JNK信號通道產生炎性反應［24］。研究表明，SM可產生細胞應激，磷酸化后激活p38MAPK信號通道，使促炎因子（如 IL-8、IL-6、TNF-α、IL-1β）表達上調［25］。也有學者認為，ERK信號通道的激活，可增加MMP-2活性。而炎性因子活性依賴于MAPK信號通道，誘導MAPK/ERK信號通道活化，可激活NF-κβ和ERK蛋白轉錄至細胞核調節轉錄因子活性，產生相應的細胞效應［19，23］。本研究表明，SM誘導急性肺損傷相關炎性蛋白表達與炎性因子水平關系密切。促炎因子可增加JNK和p38MAPK的活化作用，并通過活化的MAPK信號轉錄通道調節基因表達水平和蛋白功能［26-27］。筆者認為，腹腔和氣管途徑SM（1LD50）對肺所產生的生物化學效應（炎性因子和相關炎性蛋白）的差異性，推測可能與SM對腹腔的腹膜和氣管的黏膜局部屏障作用的機制和作用的面積不同導致毒素吸收入血濃度的差異有關。SM可誘導肺巨噬細胞釋放促炎介質和細胞因子，刺激中性粒細胞溢出和集聚［15］。在損傷部位，中性粒細胞通過脫顆粒和髓過氧化物酶釋放改變肺組織的微環境，從而啟動肺損傷［28］。

綜上所述，SM（1LD50）染毒，經腹腔注射大鼠血清炎性因子水平和肺泡間隔相關蛋白表達明顯高于經氣管灌注，提示SM誘導的肺炎性反應與染毒途徑有關。不同途徑SM（1LD50）誘導急性肺損傷，取決于毒物作用的靶器官和代謝的基礎。SM誘導的急性肺損傷毒理學機制錯綜復雜，引發的細胞和分子水平的炎性反應是啟動肺損傷的關鍵環節。建立經腹腔和氣管途徑SM（1LD50）誘導急性肺損傷模型，可為SM肺損傷的抗炎靶向治療提供理論依據。

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