p—CHEK2在浸潤性乳腺癌中的表達和臨床意義

胡曉華 王寧 王雅杰

[摘要] 目的 研究在浸潤性乳腺癌組織中磷酸化細胞周期檢查點激酶2（p-CHEK2Thr68）的表達情況，并探討其臨床意義。 方法 收集2007年1月～2011年12月第二軍醫大學附屬長海醫院及黃浦區中心醫院289例乳腺癌改良根治術后病理標本。采用免疫組化方法檢測組織中p-CHEK2Thr68的表達情況，分析其與臨床病理參數之間的關系。 結果 在乳腺癌組織中p-CHEK2Thr68陽性表達率為26.0%（75/289），癌旁組織的陽性表達率為0%，差異有統計學意義（P < 0.05）。p-CHEK2Thr68表達率在無淋巴結轉移組高于有淋巴結轉移組，在ER陰性組高于ER陽性組，PR陰性組高于PR陽性組，HER2陰性組高于HER2陽性組，三陰性乳腺癌組高于非三陰性乳腺癌組，差異有統計學意義（P < 0.05），而p-CHEK2Thr68的表達與患者的發病年齡、月經狀態、組織分級、腫瘤大小、TNM分期、P53狀態無關（P > 0.05）。 結論 采用免疫組化方法檢測乳腺癌組織中p-CHEK2Thr68的表達情況以觀察其生物學行為，將有助于制訂乳腺癌患者的個體化治療方案。

[關鍵詞] 乳腺癌；p-CHEK2；免疫組織化學

[中圖分類號] R73 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）03（b）-0092-04

Expression and clinical significance of p-CHEK2 in invasive breast cancer

HU Xiaohua WANG Ning WANG Yajie

Department of Oncology， Changhai Hospital Affiliated to Second Military Medical University， Shanghai 200433， China

[Abstract] Objective To detect protein expression of phosphorylated chekpoint kinase 2 （P-CHEK2Thr68） in invasive breast cancer tissues and reveal the relevant clinical significance. Methods Totally 289 cases of invasive ductal breast cancer tissues were collected from January 2007 to December 2011 in Changhai Hospital Affiliated to Second Military Medical University and Shanghai Huangpu District Central Hospital. The expression of p-CHEK2Thr68 was analyzed by immunohistochemistry， and its relationship with clinicopathological parameters was analyzed. Results The positive expression rate of p-CHEK2Thr68 in breast cancer tissues was 26.0% （75/289）， the positive expression rate of the adjacent tissues was 0%， the difference was statistically significant （P < 0.05）. P-CHEK2Thr68 expression rate in the non-lymph node metastasis group was higher than the lymph node metastasis group， the ER negative group was higher than the ER positive group， the PR negative group was higher than the PR positive group， the HER2 negative group was higher than the HER2 positive group. P-CHEK2Thr68 expression rate in the tri-negative breast cancer group was higher than non-tri-negative breast cancer group， the difference was statistically significant （P < 0.05）. There was no relationships between p-CHEK2Thr68 expression and the age， menstrual status， histological grade， pathological type， tumor size， TNM stage and p53 status. Conclusion Detection of p-CHEK2Thr68 protein expression by immunohistochemistry may help to investigate the biological behavior of invasive breast cancer and to develop individualized treatment strategy.

[Key words] Breast cancer； P-CHEK2； Immunohistochemistry

乳腺癌是當今世界范圍內危害女性健康的惡性腫瘤之一，發病率和病死率在發展中國家逐年上升，成為當前社會重大的公共衛生問題[1]。細胞周期檢測點激酶2（cell cycle checkpoint kinase 2，CHEK2）是由抑癌基因CHEK2編碼的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在組織細胞DNA損傷修復通路中，CHEK2是細胞DNA雙鏈斷裂損傷信號轉導中的一個重要成員，其關鍵氨基酸殘基發生磷酸化后形成p-CHEK2Thr68，通過檢查點機制激活下游相關分子以調節細胞周期，同時激活修復相關基因使DNA損傷得以修復[2]。本研究采用乳腺癌組織芯片，通過免疫組化方法了解乳腺癌組織中p-CHEK2Thr68的表達狀況，進而分析臨床病理參數與其相關性，并初步探討其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集2007年1月～2011年12月第二軍醫大學附屬長海醫院及黃浦區中心醫院289例乳腺癌改良根治術后病理標本。經甲醛固定、石蠟包埋后構建組織芯片4張。納入研究患者均為女性，年齡31～85歲，未絕經患者119例，絕經患者170例。腫瘤直徑≤ 2 cm共106例，腫瘤直徑> 2 cm共183例；組織學分級Ⅰ～Ⅱ級202例，Ⅲ級87例；區域淋巴結轉移陽性106例，陰性183例；ER陽性145例，ER陰性44例；PR陽性172例，PR陰性117例；HER2陽性176例，HER2陰性113例。按照AJCC（american joint committee on cancer）乳腺癌TNM分期系統，I期70例，Ⅱ～Ⅲ期219例；ER、PR、HER2均陰性的三陰性乳腺癌患者51例。術后病理確診為單側乳房原發性乳腺癌，排除遠處轉移及炎性乳腺癌，未進行過術前放療、化療及內分泌和分子靶向治療，均行腋淋巴結清掃，術后病理進行組織學分級和P53、ER、PR、HER2免疫組化檢測。90例經同期病理確診的乳腺癌旁組織進行對照，按相同方法制成組織芯片2張。

1.2 試劑和方法

兔抗人單克隆p-CHEK2Thr68抗體購自Cell Signaling Technology 公司，采用SP免疫組化法檢測p-CHEK2Thr68表達。標本病理診斷經筆者醫院兩位以上病理科醫師確定。免疫組化檢測按照試劑盒說明書要求操作，經脫蠟至水、pH6.0檸檬酸鹽高壓鍋熱處理抗原修復、3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，分別加一抗、二抗、DAB顯色、蘇木精復染。用已知p-CHEK2Thr68陽性的乳腺癌切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定標準

免疫組化染色結果均由兩位病理科醫師盲態評估確定。p-CHEK2Thr68表達定位于細胞核，結果判定采用二級計分法，按細胞核染色強度分為：不著色（0分）、淡黃色（1分）、棕黃色（2分）、棕褐色（3分）；按陽性細胞百分率分別為：≤ 5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。結果綜合判定取二者分值之積：0～4分判定為p-CHEK2Thr68陰性，5～12分判定為p-CHEK2陽性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件行數據處理，p-CHEK2Thr68蛋白表達與病理參數相關性的比較采用Pearson χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 p-CHEK2Thr68在乳腺癌組織中及癌旁組織中的表達

本研究觀察到在乳腺癌組織和癌旁組織中p-CHEK2Thr68染色均在細胞核中分布，未見細胞漿染色現象，乳腺癌組織中p-CHEK2Thr68染色強度相對高于癌旁組織。見圖1（封四）。

以p-CHEK2Thr68定位于細胞核來評估表達情況，經二級計分法判定p-CHEK2Thr68在乳腺癌中的表達率明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 p-CHEK2Thr68表達水平與乳腺癌臨床病理參數的關系

p-CHEK2Thr68在無淋巴結轉移組的表達率高于有淋巴結轉移組，在ER陰性組高于ER陽性組，PR陰性組高于PR陽性組，HER2陰性組高于HER2陽性組，在三陰性乳腺癌中高于非三陰性乳腺癌，差異有統計學意義（P < 0.05），而p-CHEK2Thr68的表達與患者的發病年齡、月經狀態、組織分級、腫瘤大小、TNM分期、P53狀態之間的差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

3 討論

CHEK2（chenkpoint kinase 2）基因位于染色體22q12.1，包含14個外顯子，編碼蛋白為543個氨基酸。激酶區位于靠近C端的功能區，很多與腫瘤相關并且影響CHEK2激酶活性的突變都位于該區[3]。在無細胞DNA損傷時，CHEK2通常以無活性的單體分布于細胞核中。當DNA發生損傷時，尤其是發生DNA雙鏈斷裂損傷時，毛細血管擴張性共濟失調突變（ataxia telangiectasia mutation，ATM）基因激活，進而誘導CHEK2聚集到受損染色體，促進CHEK2激酶的Thr68、Thr383和Thr387等一些關鍵氨基酸殘基的磷酸化[4-5]。

作為一種蛋白激酶，CHEK2的活化起始于Thr68位點的磷酸化，而后進一步激活T-Loop環上的Thr383和Thr387位點，啟動CHEK2蛋白的自磷酸化過程，形成能夠發揮生物學作用的二聚體[6]。Thr68磷酸化是CHEK2蛋白活化的重要始動環節，最能反映CHEK2激酶的活性[7]。Carlessi等[8]發現多種腫瘤組織中都存在著不同程度的p-CHEK2 Thr68位點的磷酸化，而在正常組織、增生組織和炎性組織中未能檢測到相同現象。Oka[9]等也發現，p-CHEK2Thr68蛋白在晚期腸癌患者腫瘤組織中的表達高于正常組織和腺瘤組織。在本研究中，應用CST公司的Phospho-Chk2（Thr68、C13C1）抗體檢測人大腸癌組織的p-CHEK2Thr68蛋白表達，該抗體被廣泛應用于前列腺癌、口腔鱗癌、胰腺上皮內瘤變等組織的p-CHEK2Thr68蛋白組織學檢測，具有可信的靈敏度和特異性[10-12]。本研究發現p-CHEK2Thr68蛋白在乳腺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，提示腫瘤組織中存在CHEK2激酶Thr68位點的活化。

據文獻報道，CHEK2基因多態性可能是食道癌淋巴結轉移的保護性因素，但關于p-CHEK2Thr68在乳腺癌淋巴結轉移中的作用尚不明確[13-14]。本研究發現，p-CHEK2Thr68陽性表達率在無淋巴結轉移組顯著高于有淋巴結轉移組，提示其與乳腺癌淋巴結轉移具有潛在的相關性。在臨床上三陰性乳腺癌的無疾病生存時間和無進展生存時間都相對較短，復發轉移性三陰性乳腺癌在治療早期緩解后很容易出現疾病的再次進展[15]。本研究發現，三陰性乳腺癌中p-CHEK2Thr68蛋白水平明顯高于非三陰性乳腺癌，提示CHEK2激酶活化和DNA損傷修復通路可能參與三陰性乳腺癌的疾病進展。有研究表明，靶向抑制CHEK2明顯降低腫瘤細胞的DNA損傷修復功能，并且使腫瘤對化療藥物重新獲得敏感，提示CHEK2和其調節的細胞DNA損傷修復通路與腫瘤化療的耐受性密切相關[16]。Liang等[17]發現順鉑誘導的卵巢癌細胞CHEK2磷酸化依賴于野生型P53；在P53缺陷細胞，順鉑不能誘導CHEK2蛋白磷酸化。CHEK2抑制劑可提高順鉑對p53缺陷腫瘤細胞的療效。因此有望通過CHEK2抑制劑的聯合使用以實現鉑類藥物耐藥的逆轉。

相關研究發現乳腺癌患者中p-CHEK2Thr68蛋白陽性的患者較陰性患者總生存期短，提示CHEK2激酶的活化可能參與放、化療耐受，p-CHEK2Thr68表達陽性的乳腺癌可能更易于發生放化療耐藥[18]。抑制CHEK2的功能可能會提高腫瘤治療的反應性，逆轉腫瘤耐藥，改善預后[19]。近年來，針對細胞周期檢查點的分子靶向藥物臨床試驗已經在進行中，靶向抑制CHEK2激酶將有望成為乳腺癌治療的新方向[20]。

綜上所述，本研究發現，p-CHEK2Thr68蛋白在乳腺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，且與臨床病理參數相關。提示采用免疫組化方法檢測乳腺癌組織中p-CHEK2Thr68的表達情況以觀察其生物學行為，將有助于制定乳腺癌患者的個體化治療方案。

[參考文獻]

[1] Li T，Mello-Thoms C，Brennan PC. Descriptive epidemiology of breast cancer in China：incidence，mortality，survival and prevalence [J]. Breast Cancer Res Treat，2016，159（3）：395-406.

[2] Apostolou P，Papasotiriou I. Current perspectives on CHEK2 mutations in breast cancer [J]. Breast Cancer（Dove Med Press），2017，9：331-335.

[3] Cai Z，Chehab NH，Pavletich NP. Structure and activation mechanism of the CHK2 DNA damage chekpoint kinase [J]. Mol Cell，2009，35（6）：818-829.

[4] Manic G，Obrist F，Sistigu A，et al. Trial Watch：Targeting ATM-CHK2 and ATR-CHK1 pathways for anticancer therapy [J]. Mol Cell Oncol，2015，2（4）：e1012976.

[5] Yan S，Sorrell M，Berman Z. Functional interplay between ATM/ATR-mediated DNA damage response and DNA repair pathways in oxidative stress [J]. Cell Mol Life Sci，2014，71（20）：3951-3967.

[6] Gabant G，Lorphelin A，Nozerand N，et al. Autophosphorylated residues involved in the regulation of human chk2 in vitro [J]. J Mol Biol，2008，380（3）：489-503.

[7] Zannini L，Delia D，Buscemi G. CHK2 kinase in the DNA damage response and beyond [J]. J Mol Cell Biol，2014，6（6）：442-457.

[8] Carlessi L，Buscemi G，Fontanella E，et al. A protein phosphatase feedback mechanism regulates the basal phosphorylation of Chk2 kinase in the absence of DNAdamage [J]. Biochim Biophys Acta，2010，1803（10）：1213-1223.

[9] Oka K，Tanaka T，Enoki T，et al. DNA damage signaling is actvated during cancer progression in human colorectal carcinoma [J]. Cancer Biol Ther，2010，9（3）：246-252.

[10] Fan C，Quan R，Feng X，et al. ATM activation is accompanied with earlier stages of prostate tumorigenesis [J]. Biochim Biophys Acta，2006，1763（10）：1090-1097.