超聲波輔助酶法提取枇杷葉多糖工藝研究

（吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南吉首 416000）

枇杷葉為薔薇科植物枇杷（Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.）的干燥葉，有清肺止咳、降逆止嘔的功效，主要用于治療肺熱咳嗽、胃熱嘔逆、口渴煩熱[1]等癥。由于枇杷葉的平咳祛痰功效可能與其機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能密切相關(guān)，而多糖物質(zhì)的一個(gè)主要活性就是免疫調(diào)節(jié)[2-4]，故對其提取方法進(jìn)行優(yōu)化選擇，為枇杷葉中水溶性多糖的提取提供參考。

多糖因具有抗炎癥、抗凝血、抗輻射、降血脂等作用，而成為天然藥物的研究熱點(diǎn)之一，植物多糖的提取物現(xiàn)已被制成多種保健品。現(xiàn)有研究表明，枇杷葉多糖能明顯提高小鼠抗疲勞能力，目前全球至少有12種多糖分別作為抗腫瘤藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。枇杷葉多糖成品液可制成枇杷葉多糖口服液或枇杷葉多糖口服膠囊，易服用和攜帶。

目前，國外對于枇杷葉多糖的研究報(bào)道較少，而國內(nèi)的研究主要集中在提取枇杷萜類、熊果酸、苦杏仁苷等方面，僅有的幾篇枇杷多糖提取的研究報(bào)道也多集中在酸浸堿提、超聲波提取[5]、超聲-微波協(xié)同萃取[6]，少有超聲波輔助酶法提取枇杷葉多糖的研究報(bào)道。開展枇杷葉多糖的綜合提取研究工作，可為枇杷資源綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器和藥品

1.1.1 試驗(yàn)儀器

DS-1型高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠產(chǎn)品；SB-3200YDTD型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；HH.S型精密恒溫水浴鍋，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；GZX-9246MBE型數(shù)顯熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；LXJ-IIB型飛鴿牌離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；ES-3KCA型電子計(jì)數(shù)天平，沈陽龍騰電子有限公司產(chǎn)品；721E型可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-25型數(shù)字式pH計(jì)，上海日島科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 試驗(yàn)材料

枇杷葉，產(chǎn)自湖南湘西自治州；果膠酶（1 016 250 U/g，湖州純米生物科技有限公司提供；蒽酮、濃硫酸、葡萄糖、95%乙醇，均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 枇杷葉多糖提取工藝流程

枇杷葉→清洗→干燥→粉碎→過篩→稱量→料液混勻→超聲波處理→冷卻→調(diào)pH值→酶解處理→滅酶→離心分離→取上清液測量體積→乙醇沉淀→離心→取沉淀溶解稀釋→測定多糖得率。

1.2.2 枇杷葉多糖含量的測定

采取硫酸-蒽酮法測定枇杷葉多糖含量，吸取枇杷葉多糖樣液之前充分搖勻，在波長620 nm處測量其吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算枇杷葉多糖含量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

分別探討超聲波處理時(shí)間、料液比、酶解時(shí)間、果膠酶用量、酶解溫度、pH值對枇杷葉多糖提取效果的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，選擇果膠酶用量、酶解溫度、pH值、料液比為響應(yīng)面優(yōu)化的考查因素，以枇杷葉多糖提取率為響應(yīng)值進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在多組試驗(yàn)得出試驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用SAS 8.1軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到優(yōu)化試驗(yàn)工藝參數(shù)，并進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)[7-9]。

1.2.5 枇杷葉多糖得率的計(jì)算

式中：C——樣液中多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；

D——樣液體積，100 mL；

E——上清液體積，mL；

F——吸取上清液體積，10 mL；

W——枇杷葉質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助酶法單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲波處理時(shí)間對枇杷葉多糖得率的影響

稱取枇杷葉粉末5.0 g，料液比1∶10（g∶mL），超聲波處理溫度50℃，處理時(shí)間分別為30，45，60，75，90 min，冷卻，調(diào)pH值為4.5，再用添加量為0.4%的果膠酶處理，在50℃水浴酶解2 h后于80℃下水浴滅酶15 min。

超聲波處理時(shí)間對枇杷葉多糖得率的影響見圖1。

由圖1可知，枇杷葉多糖得率隨著超聲提取時(shí)間的延長而升高，在60 min達(dá)到最大，而在60～90 min，枇杷葉多糖得率沒有明顯變化。由于在提取的初期，超聲波對細(xì)胞膜的破碎作用比較大，枇杷葉多糖被不斷浸出，但隨著提取時(shí)間的延長，枇杷葉多糖的浸出量達(dá)到最大，再延長時(shí)間也不能將多糖得率提高，故超聲波處理時(shí)間選擇60 min。

圖1 超聲波處理時(shí)間對枇杷葉多糖得率的影響

2.1.2 料液比對枇杷葉多糖得率的影響

稱取枇杷葉粉末5.0 g，料液比分別為1∶10，1∶12，1∶14，1∶16，1∶20 （g∶mL），超聲波處理溫度為50℃，處理時(shí)間為30 min，冷卻，調(diào)pH值為4.5，再用添加量0.4%的果膠酶處理，在50℃水浴中酶解2 h后于80℃條件下水浴滅酶15 min。

料液比對枇杷葉多糖得率的影響見圖2。

圖2 料液比對枇杷葉多糖得率的影響

由圖2可知，枇杷葉多糖得率隨著料液比增加而升高，在料液比1∶16時(shí)達(dá)到最高，之后隨料液比增加而下降。由于料液比1∶10時(shí)，體系黏稠度大，經(jīng)超聲處理后體系內(nèi)乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，酶與底物接觸不充分，酶解效果差；隨著料液比增加，乳化現(xiàn)象減弱，酶解效果增強(qiáng)；繼續(xù)增加料液比，底物濃度降低，酶解效果減弱，多糖得率下降，故料液比選擇1∶16。

2.1.3 酶解時(shí)間對枇杷葉多糖得率的影響

稱取枇杷葉粉末5.0 g，料液比為1∶16（g∶mL），超聲波處理溫度50℃，處理時(shí)間30 min，冷卻，調(diào)pH值4.5，再用添加量為0.4%的果膠酶處理，在50℃水浴酶解，時(shí)間分別為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，于80℃下水浴滅酶15min。

酶解時(shí)間對枇杷葉多糖得率的影響見圖3。

由圖3可知，枇杷葉多糖得率隨著酶解時(shí)間增加而升高，當(dāng)酶解時(shí)間超過2 h后，枇杷葉多糖得率增加趨于平緩。這主要是因?yàn)闀r(shí)間短，酶促反應(yīng)不充分；增加酶解時(shí)間可以使果膠酶對細(xì)胞壁中的果膠物質(zhì)充分酶解，但酶解時(shí)間過長，酶的催化活性降低，進(jìn)而對枇杷葉多糖得率影響不大，所以酶解的最佳時(shí)間為2 h。

圖3 酶解時(shí)間對枇杷葉多糖得率的影響

2.1.4 果膠酶添加量對枇杷葉多糖得率的影響

稱取枇杷葉粉末5.0 g，料液比1∶16（g∶mL），超聲波處理溫度50℃，處理時(shí)間30 min，冷卻，調(diào)pH值4.5，分別用添加量0.4%，0.8%，1.2%，1.6%，2.0%的果膠酶處理，在50℃水浴酶解2 h后于80℃下水浴滅酶15 min。

果膠酶添加量對枇杷葉多糖得率的影響見圖4。

圖4 果膠酶添加量對枇杷葉多糖得率的影響

由圖4可知，枇杷葉多糖得率隨著果膠酶添加量增加而升高，由于果膠是植物組織中與纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)等結(jié)合的不溶于水的一類物質(zhì)，果膠酶有利于多糖的釋放，當(dāng)果膠酶添加量超過1.6%后，枇杷葉多糖得率的增加趨于平緩，綜合考慮酶成本及多糖得率，故果膠酶添加量為1.6%。

2.1.5 酶解pH值對枇杷葉多糖得率的影響

稱取枇杷葉粉末5.0 g，料液比1∶16（g∶mL），超聲波處理溫度50℃，處理時(shí)間30 min，冷卻，調(diào)pH值分別為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，再用添加量為0.4%的果膠酶處理，在50℃水浴中酶解2 h后于80℃下水浴滅酶15 min。

酶解pH值對枇杷葉多糖得率的影響見圖5。

圖5 酶解pH值對枇杷葉多糖得率的影響

由圖5可知，枇杷葉多糖得率在pH值為4.5最高，由于果膠酶受pH值影響較大，pH值4.5時(shí)果膠酶發(fā)揮最大活力，破壞細(xì)胞壁的效率大大增強(qiáng)，使枇杷葉溶出效率也達(dá)到最大值；pH值過高或者過低都會抑制果膠酶活力；pH值可以通過影響底物分子的解離影響反應(yīng)速度，故選擇pH值為4.5。

2.1.6 酶解溫度對枇杷葉多糖得率的影響

稱取枇杷葉粉末5.0 g，料液比為1∶16（g∶mL），超聲波處理溫度50℃，處理時(shí)間30 min，冷卻，調(diào)pH值4.5，用添加量為0.4%的果膠酶處理，分別在水浴溫度為35，40，45，50，55℃的條件下酶解2 h后于80℃條件下水浴滅酶15 min。

酶解溫度對枇杷葉多糖得率的影響見圖6。

圖6 酶解溫度對枇杷葉多糖得率的影響

由圖6可知，隨著酶解溫度升高，枇杷葉多糖得率在50℃最高，高于50℃時(shí)，多糖得率反而下降。由于溫度升高時(shí)，分子熱運(yùn)動加快，活化分子數(shù)增多，從而使反應(yīng)速度加快；超過最適溫度后，隨著溫度升高酶蛋白開始變性，酶活力逐漸降低，從而影響多糖提取，故果膠酶酶解溫度選擇50℃。

2.2 Box-Behnken中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化枇杷葉多糖提取工藝

2.2.1 優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken中心設(shè)計(jì)原理，以果膠酶添加量（X1）、酶解溫度（X2）、pH值（X3）、料液比（X4）為自變量，枇杷葉多糖得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)，共27個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中24個(gè)為分析因子（1～24），3個(gè)中心試驗(yàn)點(diǎn)（25～27）。

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)

2.2.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

2.2.3 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

回歸統(tǒng)計(jì)分析見表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸統(tǒng)計(jì)分析

經(jīng)SAS 8.1軟件對27個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的枇杷葉多糖得率進(jìn)行回歸分析，得出數(shù)學(xué)模型：

從表3可看出模型極顯著（p＜0.000 1），因變量與所考查自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=97.83%），模型調(diào)整確定系數(shù)=95.31%，說明響應(yīng)值的變化有97.83%來源于所選因子變化，擬合程度良好，失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），說明試驗(yàn)所得二次回歸方程高度顯著，能很好地對響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測。一次項(xiàng)X3，X4及二次項(xiàng)表現(xiàn)為極顯著，X2、X3X4顯著，說明它們對響應(yīng)值影響大，且所考查因素對響應(yīng)值影響不是簡單的一次線性關(guān)系。由表3可知，影響因素主次順序?yàn)閜H值＞料液比＞酶解溫度＞果膠酶添加量。

2.2.4 響應(yīng)面圖形分析

果膠酶添加量（X1）、酶解溫度（X2）、pH值（X3）、料液比（X4）交互作用的響應(yīng)面及等高線圖，直觀地反映各因素對響應(yīng)值的影響，找出最佳工藝參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用，從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等高線可以看出在所選的范圍內(nèi)存在極值，響應(yīng)面的最高點(diǎn)同時(shí)也是等高線中的最小橢圓的中心點(diǎn)。此外，等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。

Y1=f（X1，X2）的響應(yīng)面和等高線見圖7（a），Y1=f（X1，X3）的響應(yīng)面和等高線見圖 7（b），Y1=f（X1，X4）的響應(yīng)面和等高線見圖 7（c），Y1=f（X2，X3）的響應(yīng)面和等高線見圖 7（d），Y1=f（X2，X4）的響應(yīng)面和等高線見圖 7（e），Y1=f（X3，X4）的響應(yīng)面和等高線見圖 7（f）。

2.2.5 最優(yōu)條件的求解及驗(yàn)證

由SAS軟件分析并考慮實(shí)際操作性，故選定調(diào)整后工藝參數(shù)為酶添加量1.9%，酶解溫度52℃，酶解pH值4.5，料液比1∶15。在優(yōu)化后的條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，測得枇杷葉多糖得率為4.967%，4.971%，4.972%，即平均值為4.97%，與理論計(jì)算值誤差在1%以內(nèi)。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)考查了果膠酶添加量、酶解溫度、pH值、料液比對枇杷葉多糖得率的影響并通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化分析，建立了枇杷葉多糖提取率的數(shù)學(xué)模型：得到的最佳的條件為超聲波處理時(shí)間60 min，酶解時(shí)間2 h，酶添加量1.9%，酶解溫度52℃，酶解pH值4.5，料液比1∶15。在此工藝條件下，枇杷葉多糖的理論得率4.973%，實(shí)際測得平均得率為4.97%。從測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，枇杷葉中可溶性多糖的含量較高，可回收提取利用，而超聲波輔助酶法提取具有時(shí)間短、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，可供枇杷葉中水溶性多糖的提取提供參考。

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