植物microRNA響應非生物脅迫研究進展

吳美婷，楊曉玉，2，羅淋淋，莫蓓莘，劉 琳

（1. 深圳大學生命與海洋科學學院/廣東省植物表觀遺傳學重點實驗室，廣東 深圳 518060；2. 深圳大學光電工程學院/光電子器件與系統（教育部/廣東省）重點實驗室，廣東 深圳 518060）

microRNA （miRNA）是一類長度約為20～24 nt的非編碼小RNA （small non-coding RNA），廣泛分布于各類動植物中，在動植物基因表達的調控中發揮關鍵作用。成熟miRNA是由RNA聚合酶Ⅱ（Pol-Ⅱ）轉錄產生初級轉錄本（primary-miRNA，pri-miRNA）、經過核糖核酸酶DCL1 （DICER-LIKE 1）加工后形成的miRNA/miRNA*雙鏈聚合體而來，并且該過程可受一系列轉錄因子的調控［1］。成熟miRNA進一步與Argonaute （AGO）蛋白等結合形成RISC復合體（RNA-induced silencing complex），通過直接切割靶基因mRNA或抑制靶基因翻譯，以及通過切割來源于PHAS位點的轉錄本產生的大量phasiRNA而間接作用于靶基因mRNA，實現對靶基因表達的抑制，進而調控動植物的生長發育進程以及逆境響應［2-3］。

1993年，研究人員從秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中發現了第一個miRNAlin-4，它是線蟲發育早期必需的調控因子。隨后，人們陸續在其他物種中發現了數以千計的miRNA。其中，在模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組中發現了325個miRNA基因，在重要的農作物水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）以及園藝作物番茄（Solanum lycopersicum）中則分別發現了592、172、77個miRNA基因［4］。這些在植物中報道的miRNA多數具有高度的保守性，但同時呈現出一定的物種間差異性以及時空表達特異性，在植物根、莖、葉、花器官和果實的生長發育及生物和非生物逆境響應中發揮著重要的調控作用。本文綜述了近年來植物miRNA的生物學特性及其參與非生物脅迫響應調控方面的研究進展，并探討了今后該領域研究的主要發展方向。

1 miRNA的生物合成、降解及作用方式

1.1 miRNA的生物合成

圖1 miRNA的生物合成、降解及作用機制

植物miRNA的生物合成是一個精確而復雜的過程（圖1）。經典的miRNA生物合成是以Pol-Ⅱ作用下miRNA基因轉錄形成primiRNA開始，隨后pri-miRNA 折疊成一個特定的二級莖環（stem-loop）發夾結構，該發夾結構可被具有核糖核酸酶活性的DCL1家族成員等形成的蛋白切割復合體（dicing body）識別并裂解形成70～350 nt的莖環狀前體（precusor miRNA，pre-miRNA），并在HYL1 （Hyponastic Leaves1）和SE （Serrate）的作用下被進一步加工成miRNA/miRNA*復合體，該二聚體隨后經HEN1 （Hua Enhancer1）甲基轉移酶甲基化修飾并在HST （HASTY）蛋白作用下出核，成熟miRNA與AGO蛋白可結合形成RISC復合體調控靶基因的表達［3-6］。進一步研究發現，CBP20 （Cap-binding Protein20）和CBP80 （Capbinding Protein80）在miRNA合成過程中發揮著與SE和HYL1類似的功能，同時剪接因子RS40和RS41以及RNA結合蛋白HOS5也直接參與miRNA的合成，并且RNA結合蛋白SE和HYL1與DCL之間的互作是調控pri-miRNA加工的重要機制［3，7-8］。

1.2 miRNA的降解

成熟miRNA的穩定性對于其功能的正常發揮具有重要意義。植物在長期進化過程中形成了多種機制以維持體內miRNA水平的穩定。HEN1介導的miRNA 3′末端核糖2′-O-甲基化修飾是維持成熟miRNA穩定性的重要機制之一。HEN1是一個Mg2+依賴型的甲基轉移酶，可與DCL1/HYL1/miRNA復合物結合，將甲基從輔因子S-腺苷-L-甲硫氨酸轉移到雙鏈miRNA分子3′末端核苷酸的2′-OH基團上，避免其尿苷酸化和降解。SDN （SMALL RNA DEGRADING NUCLEASE）蛋白具有3′→5′核酸外切酶的活性，可介導2′-O-甲基化miRNA由3′→5′的降解，限制miRNA在擬南芥中的積累；SDN蛋白的失活可導致miRNA豐度增加和植物發育異常，離體實驗表明，AGO10結合的miR165/166對SDN1的作用敏感，AGO10可通過促進SDN1和SDN2介導的miR165/166的降解來減少miR165/166在體內積累［3］。核苷酸轉移酶HESO1 （Hen1 Suppressor1）和URT1 （UTP：RNA Uridylyltransferase1）介導的miRNA的尿苷化降解也是植物體內避免成熟miRNA過量積累的重要機制，HESO1和URT1通過參與miRNA 3′端的加尾影響miRNA的降解和活性；HESO1和URT1均可向未被甲基化修飾miRNA的3′端添加寡聚尿苷酸尾使其降解，但二者對miRNA 3′端核苷酸具有不同的偏好，HESO1優先催化3′端以U結尾的miRNA加尾，而URT1則優先催化3′端以A結尾的miRNA 加尾［8］。

1.3 miRNA的作用方式

圖2 miRNA參與植物生長發育的調控

miRNA可通過剪切或者翻譯抑制的方式對靶基因的表達進行調控，進而影響植物的生長發育過程，包括根的形成、莖葉的發育、花器官的形成、果實的發育等（圖2）。miRNA可能調控一類靶基因家族的多個靶基因成員，同一類靶基因也可能參與植物的多種生長發育調控過程。靶基因mRNA上與miRNA互補的區域通常被稱作miRNA響應元件（miRNA response element，MRE），植物中的MRE大多分布在靶基因的編碼區以及5′和3′非翻譯區（untranslated region，UTR）。當miRNA與靶基因mRNA上的MRE完全互補或幾乎完全互補時，RISC復合體中的AGO可使靶基因的上MRE與miRNA 序列配對區域第10～11位核苷酸之間的磷酸二酯鍵發生裂解，裂解產物隨后進一步被核酸外切酶降解。miRNA介導的轉錄產物裂解屬于轉錄后水平的調節，是植物中miRNA調控靶基因表達的主要途徑。此外，當miRNA與靶基因的MRE序列不完全互補時，它可通過與靶基因MRE的不完全互補配對進而阻抑靶基因mRNA的翻譯過程，該途徑對mRNA的穩定性無影響，屬于翻譯水平的基因調節，可由靶基因的mRNA與蛋白豐度的不一致所反映，該過程主要發生在植物細胞的內質網結構，需要AMP1 （Altered Meristem Program1）蛋白參與介導實現［9］。

表1 miRNA對植物非生物脅迫的響應

2 miRNA參與植物的非生物脅迫應答調控

溫度、光照、水分和礦質元素等是植物生長發育所必需的環境因子。由于外部環境因子的多變性，植物常常會面臨一種或多種不利環境因子的脅迫，影響正常的生長發育過程。環境脅迫分為生物和非生物脅迫，其中非生物脅迫主要是指干旱脅迫、鹽脅迫、高低溫脅迫、養分脅迫以及重金屬脅迫等。在長期的進化過程中，植物形成了一系列響應各種非生物脅迫的機制，其中miRNA介導的非生物脅迫響應網絡是植物應答各種非生物脅迫的重要機制之一。表1總結了近年報道的參與植物非生物脅迫響應的主要miRNA。非生物脅迫下，植物可通過調節某些miRNA的表達或者產生一些新的miRNA來調節自身對脅迫的耐受性，以便在逆境下得以生存。與動物相比，盡管植物中miRNA調控的靶基因在全部基因中所占比重較低，但由于這些靶基因大多為轉錄因子，因此miRNA參與的植物逆境響應機制更為復雜。

2.1 干旱脅迫

干旱是世界性的生態危機，也是制約農業生產的主要脅迫之一，闡明植物的耐旱機制、培育耐旱品種、提高水資源的利用率是今后農業科研中亟需解決的問題。在擬南芥中，miR156、miR159、miR160、miR165、miR169、miR171、miR319、miR394和miR395等均可響應干旱脅迫，且干旱脅迫程度不同，miRNA的響應趨勢亦存在差異［11］。干旱脅迫下，脅迫敏感水稻的旗葉中 miR159f、miR397、miR398b、miR408-3p、miR528-5p、amiR1871和 miR2878-5p的表達量顯著下調，而脅迫鈍感水稻的上述7類miRNA的表達量顯著上調，表明這些miRNA可能在水稻耐旱性的調控中發揮著至關重要的作用［32］。植物的miRNA對干旱脅迫的響應可通過調控ABA （Abscisic Acid）依賴型靶基因的表達來實現［18］。植物體內部分miRNA基因如擬南芥miR167和miR393等的啟動子區域含有ABA信號途徑的響應元件（ABA-response elements，ABREs），可直接響應干旱脅迫下ABA信號途徑的變化，進而影響下游靶基因如生長素受體基因TIR1/AFB2 （Transport Inhibitor Response/Auxin Signaling F-Box2）和生長素響應因子ARF8 （auxin response factor8）等的表達，調控植物的生理生化過程及生長發育進程來適應外部環境中的水分供應不足［33］。ABA亦可通過miR159介導的轉錄因子如MYB101和MYB33的降解來調控植物對干旱脅迫的適應［33］。miRNA介導的ABA非依賴型靶基因表達的調控也是植物干旱脅迫響應的重要機制。干旱脅脅迫下，植物體可產生大量的乙烯，繼而激活乙烯信號通路蛋白基因EIN2 （Ethylene Insensitive2），抑制miR164的表達并促進其下游靶基因NAC1 （Nucleus Accumbens-Associated1）和ORE1 （Oresara1）等的表達，加速葉片衰老，降低植株的蒸騰作用，提高植物的保水及耐旱性［33］。此外，miR408還可通過調控質藍素等銅結合蛋白基因的表達，進而引起DREB（Dehydration Responsive Element Binding）和其他干旱響應基因的差異表達，提高植物的耐旱性［32］。

綜上，多種miRNA可參與植物對干旱脅迫響應的調控，進而影響其耐旱性，然而與目前所鑒定出的大量響應干旱脅迫的miRNA相比，進行功能驗證的miRNA數量仍相對較少，對其進行深入研究將有助于我們更好地理解干旱脅迫下miRNA參與響應的具體分子機制。

2.2 鹽脅迫

植物體內多個miRNA介導的調控途徑均可響應鹽脅迫。鹽脅迫下擬南芥中miR156、miR158、miR159、miR161、miR165、miR167、miR168、miR169、miR171、miR173、miR319、miR393、miR394、miR396和 miR397的表達上調，而miR398的表達則顯著降低［21］。Sun等［12］研究了大豆根尖分生組織中miRNA對鹽脅迫的響應，發現miR156g、miR156j、miR172f、miR390e、miR399a、miR1511、miR2111b、miR2111c和miR2111f參與了大豆根系耐鹽性的調控。水稻miRNA對鹽脅迫的響應具有明顯的品種間差異，在抗鹽水稻品種中miR156j、miR390和miR5817等的表達受到顯著抑制，而miR168a和miR535-5p等的表達則顯著升高；然而在鹽敏感品種中上述miRNA的表達則呈現截然相反的趨勢［34］。鹽脅迫下桑樹（Morus alba）有12個miRNA的表達與正常生長條件下相比具有顯著差異，其中表達量顯著上升的有novel-19*、novel-68、miR398a和 miR408，而 novel-6ae、novel-50、novel-65、miR394*、miR395、miR395*、miR827和miR2111的表達則顯著下降［35］。除了轉錄水平上的響應，miRNA轉錄后的加工過程亦可對鹽脅迫發生響應，從而影響成熟miRNA在植物體內的積累。研究表明，鹽脅迫下盡管成熟miR161和miR173的豐度顯著上升，但是其初級轉錄本的水平卻呈現下調的趨勢［36］，這種不一致性可能是由鹽脅迫下AGO1對兩個miRNA在胞質及核內的差異調控所致，首先在胞質內AGO1可與miRNA形成RISC復合體，提高miRNA的穩定性，而在細胞核內，AGO1則可結合于基因組中miRNA基因莖環結構的編碼區域，抑制miRNA基因的轉錄，導致miRNA初級轉錄本豐度的下降［37］。此外，miRNA還可通過影響生長素信號途徑參與植物對鹽脅迫響應的調控。研究發現，鹽脅迫可誘導擬南芥miR393的表達，進而抑制TIR1和AFB2的表達，激發體內的鹽脅迫響應途徑，提高擬南芥的耐鹽性，這與擬南芥tir1/afb2 雙突變體的耐鹽性顯著提高的研究結果一致［19］。

盡管目前已鑒定出多種植物的大量miRNA均可響應鹽脅迫，但除少量miRNA調控機制的研究較為透徹以外，多數miRNA參與介導的鹽脅迫響應調控機制仍不清楚，有必要在今后工作中進一步研究。

2.3 高溫與低溫脅迫

由于地理條件的差異以及季節的變化，植物在生長發育過程中常常面臨各種極端的溫度條件，這對植物的生長發育和產量形成極為不利。Li等［38］利用高通量測序技術研究了褪黑素緩解冷脅迫對西瓜（Citrullus lanatus）傷害過程中miRNA的變化，發現有50個miRNA的表達響應褪黑素處理呈顯著上調或下調趨勢，其中部分下調miRNA的靶基因可參與逆境信號轉導或者對植物具有保護和解毒功能，mRNA-seq結果顯示這些靶基因在褪黑素處理下表達量均顯著提高，表明miRNA介導的調控網絡可能參與了褪黑素對西瓜耐寒性的調控。水稻的miRNA可通過CBF（C-repeat binding transcription factor）依賴的途徑來調節其耐寒性，其中miR319的表達下調可誘導其靶基因PCF5 （Proliferating Cell Factor5）、PCF6、PCF8和TCP21的表達，繼而激活冷應激基因DREB1A/1B/1C和DREB2A，增加滲透調節物質的含量，增強水稻的耐寒性；而miR394和miR397則是水稻耐寒性的正調控因子［20］。

miRNA可參與植物對高溫脅迫的響應，但表現出明顯的種間差異。例如在高溫脅迫下小麥（Triticum aestivum）的miR160、miR166和 miR167表達量顯著上升［17］，而毛白楊（Populus tomentosa） miR160的表達則顯著下降［13］。Liu 等［17］檢測了不同品種水稻 miRNA對高溫脅迫的響應，發現miR159a.1、miR159b和miR528-3p的表達在高溫耐受型品種中受到抑制，但在敏感品種中被誘導；然而miR396e-5p和miR396f-5p的表達在高溫耐受型品種中顯著上調，但在高溫敏感品種中表達則顯著下調；此外，miR164d、miR166i-3p、miR168a-3p和miR397b在高溫脅迫處理后，無論是耐受型還是敏感型品種其表達量均呈顯著降低的趨勢。與野生型相比，過表達小麥miR159的轉基因水稻對高溫處理更敏感［14］，表明高溫處理小麥中miR159的下調可能參與高溫響應相關的信號通路，從而提高了小麥的耐熱性。miR173-TAS1-HTT（heat-induced TAS1target）-HSF（heat stress transcription factors）和miR398-CSD（Copper/Zinc Superoxide Dismutase1） /CCS（Copper Chaperone For Sod1）-HSF途徑是目前研究較為清楚的植物參與熱應激反應的重要途徑。其中，miR173-TAS1可在熱脅迫下被抑制，繼而其下游熱脅迫響應基因HTT1和HTT2高度表達，促進HSF基因的表達及積累，提高植物的耐熱性；不同于miR173，miR398是通過HSP （heat shock protein）的積累來感應熱脅迫，進而調節其下游靶基因CSD1、CSD2和CCS的表達，影響植物體內ROS （Roactive Oxygen Species）的積累和耐熱性［39］。

盡管越來越多的證據表明miRNA在植物響應極端溫度脅迫時發揮著重要的調控作用，但目前對其具體的調控機制仍有許多不明之處，需要在今后研究中逐步解析，并應用于農作物的遺傳改良中。

2.4 養分脅迫

礦物元素如氮、磷和硫等是植物生長、發育和產量形成所必需的營養元素。Ren等［18］利用小RNA測序分析了低氮脅迫下毛果楊（Populus trichocarpa）中miRNA表達的變化，鑒定出7個保守miRNA家族（miR159a/b、miR160e-3p、miR166a-m、miR169a/b-5p/c、miR172a/b-3p/c/f、miR396c/d/e-5p和 miR475a-3p/b-3p）和 1個毛果楊特有miRNA （miR6427-3p）的表達顯著降低，而3個miRNA家族（miR395b-k、miR396a/b和miR396e-3p）的表達則顯著上升，表明miRNA在植物氮響應中發揮著重要的調控作用。與正常供氮條件下的植株相比，低氮脅迫處理的菊花（Chrysanthemum morifolium）根系中有28個miRNA上調，53個下調；而在葉片中則有40和61個miRNA 分別呈現上調和下調的趨勢，其中低氮脅迫下miR169a的下調可促進NFYA（Nuclear Transcription Factor-Y Alpha） 基因的表達，以調節氮的轉運，促進菊花對低氮環境的適應［24］，這與擬南芥中的研究結果一致［40］，暗示miR169a-NFYA參與的低氮適應機制在高等植物中可能具有一定的保守性。miRNA對植物氮信號途徑成員的調控可能是其響應氮脅迫的重要機制之一。在氮信號途徑中，生長素受體AFB3受到氮信號和miR393的雙重調控，其中氮信號表現為正調控，而miR393則負調控AFB3的表達，當氮元素供應異常時，AFB的表達呈現為氮信號及miR393共調控的結果，隨后經生長素信號途徑中的Aux/IAA以及ARF等的傳遞，最終影響植物的NAC4和OBP4基因表達，調控植物對氮脅迫的適應性［41］。

無機態磷是一種十分重要的礦質元素，是植物能量供給、遺傳物質構成所必須的，缺磷可導致植物根系形態建成的異常，影響植物的正常生長發育［54］。植物的miR399是最早發現的與體內磷代謝相關的miRNA，可靶向磷轉運蛋白和泛素連接酶基因，在維持磷的平衡上起著重要作用。低磷脅迫下玉米幼苗根系中12個miRNA的表達量發生顯著變化，其中2個屬于保守的miRNA家族（miR156和miR399b），其余10個為禾本科特有的miRNA，其中miR399b和玉米特有的miR3具有共同的靶基因磷轉運蛋白基因PT1 （Phosphate Transporter1）和PT2［10］，暗示miR399b和miR3可能直接參與玉米磷酸鹽代謝調節。水稻miR399在低磷脅迫下表達量下調，從而抑制LTN1 （Leaf Tip Necrosis1）的表達，激活多種營養吸收相關基因如PTs（phosphate transporters）和磷饑餓誘導基因PSIGs（phosphate starvation-inducible genes）的表達，提高水稻對低磷脅迫的耐受性［42］。缺磷脅迫下，擬南芥的miR399表達上調并促進編碼泛素E2結合酶的PHO2 （PHOSPHATE2）mRNA的切割；時空表達分析結果顯示芽中miR399對缺磷脅迫的響應早于根［43］，這可能與miR399可作為信號分子進行長距離運輸有關，但具體的轉運機制目前仍不清楚。磷饑餓下大豆根系和葉片中的miR169f、miR399a、miR399b、miR399c和miR399d等25個miRNA受到誘導，且葉中的表達水平顯著高于根中；而miR169c和miR169r等11個miRNA的表達則被抑制［23］。miR156-SPL3 （Squamosa-Promoter Binding Protein-Like3）-Pht1.5/PLDZ2（phospholipase DZ2）/miR399f和MYB2-miR399f通路是植物低磷脅迫響應調控機制的重要組成部分。首先，低磷條件下擬南芥PHR1可促進miR156的表達，從而抑制其下游靶基因SPL3的表達，而SPL3則能通過結合啟動子中的GATC元件對PLDZ2、Pht1.5和miR399f進行調控，調節擬南芥的低磷耐受性［44］，此外，擬南芥中轉錄因子MYB2和miR399f可在相同組織中表達，MYB2可直接結合到miR399f 啟動子中的MYB結合位點并正向調節miR399f的表達，磷饑餓處理可誘導MYB2的表達，進而促進miR399f的表達以維持體內磷代謝的穩定；過表達MYB2可導致擬南芥轉基因植株的根系形態建成異常［45］。Lin 等［31］通過 Northern blot和原位雜交實驗分析了低磷脅迫下水稻miR827的表達，發現磷饑餓處理可顯著提高miR827在水稻葉肉、表皮和根中的表達，同時其靶基因SPX（SYG1/PHO8/XPR1）-MFS1 （Major Facility Superfamily1）的表達顯著減少；而其靶基因SPX-MFS2 mRNA的積累在磷饑餓下則顯著增強，反映了水稻miR827與其兩個靶基因參與磷代謝調節的復雜性。

植物可吸收環境中的無機硫元素并進一步同化為有機態硫，并以甲硫氨酸和半胱氨酸的形式參與一系列的生物及化學過程，因此在全球硫循環中發揮著極為重要的橋梁作用。研究發現擬南芥中miR156、miR160、miR164、miR167、miR168、miR394和 miR395的表達在低硫脅迫下均發生了變化［46］。低硫環境可通過促進擬南芥硫同化途徑關鍵轉錄因子SLIM1（Sulfur Limitation1）的表達，促進根和葉中的miR395的表達，與此同時，APS1 （ATP Sulfurylse1）、APS4和芽中SULTR2.1 （Sulfate Transporter2.1）的表達均發生了下調，而APS3和根系中SULTR2.1的表達卻呈現明顯的上調趨勢，組織特異性表達分析結果顯示，miR395主要在韌皮部伴胞中表達，而SULTR2.1主要在木質部的薄壁細胞中表達［46］，這種表達的空間異位可能有利于硫元素通過木質部從根系向芽中的轉運。Yuan等［28］克隆了一個來自水稻的miR395基因并研究了其對植物營養脅迫的響應，結果表明硫缺乏可誘導水稻miR395的表達及兩個靶基因表達的下調；過表達水稻miR395h的轉基因煙草中，硫酸轉運蛋白基因SULTR2的表達受到抑制，打破了硫酸鹽代謝的平衡，并對不同時期葉片中硫酸鹽的分配產生了影響。

隨著研究的逐步深入，越來越多營養脅迫響應相關miRNA不斷被發現，由其介導的響應調控機制也開始逐步被解析，這為作物營養特性的遺傳改良工作提供了更多的思路，并可促進減肥增效工作的開展以及綠色生態農業的發展。

2.5 金屬離子脅迫

miRNA在植物響應重金屬脅迫中發揮著重要作用。鎘毒害嚴重影響植物正常的生長發育，危害農業生產的可持續發展。Qiu等［16］研究了鎘脅迫下小麥miRNA表達的變化，發現根系和葉片中miR159、miR408以及根系中miR398與其對應的靶基因MYB3、CLP（Cardiac Lineage Protein）和CSD（N-Chlorosulfonyl Dicyclohexylamine）的表達水平呈顯著負相關，表明miRNA可能參與小麥對鎘脅迫響應的調控。鎘脅迫下水稻成熟miR390的豐度顯著降低，而其靶基因SRK（Serine/Threonine-Protein Kinase）的表達則明顯升高；與野生型相比，過表達miR390的轉基因水稻SRK的表達被顯著抑制，對鎘脅迫的耐受性降低［26］，暗示miR390可能是水稻耐鎘性的負調控因子之一。與野生型油菜（Brassica napus）相比，過表達miR395可抑制鎘由根系向到芽的轉運，同時金屬耐受型基因如PCS1 （Phytochelatin Synthases1）、HO1（Heme Oxygenase1）和SULTR1.1的表達上調，顯著提高了對鎘脅迫的耐受性，從而使產量增加［47］。

miRNA在植物對鋁脅迫的響應中起著關鍵的調控作用。Lima等［22］檢測了鋁脅迫下粳稻和秈稻根系miRNA表達量的變化，鑒定出粳稻根中有19個miRNA響應鋁脅迫，而在秈稻根中僅有8個，其中miR393b、miR395a、miR398a、miR398b和miR408在粳秈稻中均表現為下調，miR168a、miR399和miR528均為上調，暗示miRNA介導的鋁脅迫響應調控機制在水稻中具有一定的保守性。Burklew等［29］研究發現煙草中miR395、miR397、miR398和miR399的表達在鋁脅迫下顯著增加；Zeng等［48］以鋁脅迫處理的大豆幼苗根系為試材構建了小RNA和降解組文庫并利用高通量測序技術進行了分析，鑒定出30個響應鋁脅迫的miRNA及其下游調控的靶基因68個。植物的miR393-TIR1/AFB途徑是鋁毒害下調控根系生長的重要機制之一。首先，鋁脅迫可導致大麥中miR393的表達下調，繼而提高了其靶基因TIR1/AFB的表達，促進了根尖中的生長素信號傳導，抑制根的伸長；其次，鋁脅迫也可能促進局部生長素的生物合成或極性運輸，有助于提高根尖對生長素變化的響應以及脅迫環境的適應［27］。

銅元素既是植物的必需營養元素，也是一類重要的重金屬污染物。菜豆（Phaseolus vulgaris）的miR398b和靶基因CSD1和Nod19（Nodulation19） 在根、根瘤及葉片中表達，并可響應銅虧缺與毒害兩種逆境，表明miR398b對維持菜豆體內銅元素的穩態具有重要的調控作用；過表達miR398的轉基因菜豆和煙草中CSD1和Nod19的表達受到抑制，銅毒害等脅迫條件下ROS大量產生，植物抗性降低［30］。然而，目前關于miR398其他家族成員在響應銅脅迫中的功能尚不清楚，miR398在其他植物中是否參與對銅脅迫的響應還有待驗證。Liu等［15］利用高通量測序技術分析了銅脅迫下蘿卜中miRNA的表達變化，發現與對照植株相比，有54個已知和16個新型miRNA在銅脅迫下的表達差異顯著，其靶基因多為轉錄因子如SPLs、MYBs、ERFs（Ethylene-Responsive Transcription Factors）和bZIPs（Basic Leucine Zippers）等，可進一步調控銅轉運蛋白HMAs（Heavy Metal ATPases）、YSLs（Yellow Stripe-like1Transporter）和ABCs（ATP-Binding Cassette-Transporters）的表達，影響銅的吸收和體內的平衡。轉錄因子SPL7在miRNA對銅脅迫的響應中發揮著重要的橋梁作用。首先銅缺乏可促進SPL7的表達，繼而通過結合于銅脅迫響應miRNA基因如miR397a、miR398b/c和miR857以及銅轉運蛋白基因COPT1 （copper transporter1）、COPT2和COPT6啟動子的GATC順式作用元件上，誘導其表達并抑制miRNA靶基因的轉錄，提高植物對銅離子的吸收及轉運；相反，銅毒害會導致SPL7失活，受SPL7轉錄激活的miRNA以及銅轉運蛋白基因等的表達下調，降低銅的吸收，提高植物對銅毒害的耐受性［49］。此外，錳脅迫可誘導大豆菌根中miR172的表達顯著升高，進而抑制其靶基因AP2的表達，暗示miRNA 亦可參與植物對錳脅迫響應的調控［50］。

目前土壤的重金屬污染問題呈逐漸加重的趨勢，miRNA作為一類重要的調控因子，在植物的重金屬脅迫響應中發揮著重要作用，隨著其調控機制的逐步闡明、基因操控技術的革新，對miRNA及其調控途徑進行操控可能成為改善植物對重金屬脅迫耐受性的重要途徑，服務于重金屬污染土壤的利用。

2.6 其他非生物脅迫

miRNA介導的調控網絡也可響應機械傷害、氧化及缺氧等其他形式的非生物脅迫。例如，機械脅迫下毛果楊22個miRNA的表達發生了顯著變化，其靶基因多為發育和脅迫相關的基因，這與毛果楊在機械脅迫下的適應性生長具有高度地一致性［48］。在水稻中，miR169、miR397、miR827和miR1425 的表達水平在高H2O2條件下顯著升高，而miR172則顯著降低［52］；過表達OsmiR529的水稻可通過抑制其靶基因OsSPL2/OsSPL14的表達，激活下游活性氧清除酶類如SOD（Superoxide Dismutase）、POD（Peroxidase）等的表達，提高植物對氧化脅迫的耐受性［53］，表明miRNA的調控網絡與氧化脅迫具有一定的關聯性。

3 展望

3.1 植物miRNA的代謝

自20世紀90年代被發現，經過20多年的發展，植物miRNA領域的研究取得了長足進步，大量有關植物miRNA生物合成、降解以及作用機制的研究揭示了miRNA在植物體內主要的代謝途徑，對該途徑中更多關鍵因子的克隆和功能鑒定將使得人們對miRNA代謝通路的認識更加完整和清晰。但有關miRNA代謝過程發生的具體亞細胞定位還有待進一步探討，如AGO1蛋白如何在細胞核、細胞質以及內質網上進行分配和執行功能？蛋白切割復合體如何在細胞核內形成和行使切割功能？miRNA介導的靶基因切割發生在細胞內的什么位置？同時，目前對于植物miRNA在翻譯水平調控的靶基因的鑒定及分子機制研究仍相對匱乏，有待進一步深入探討揭示其具體過程和發生機理。以上這些問題的闡明將有助于我們深入理解miRNA在植物體內的作用機制。

3.2 植物miRNA的生物學功能

目前植物miRNA的研究主要集中在以擬南芥和水稻等為代表的模式植物上，對于其他重要農作物的研究仍相對匱乏，特別是物種特異的miRNA有待被進一步發現。其次，多數miRNA功能的研究仍以過表達或者基因沉默技術為主，缺乏相關的突變體證據，CRISPR/Cas9基因組編輯技術的出現將有效解決這一問題，幫助獲得大量定點定向突變體，豐富實驗資源。此外，多項研究發現除了成熟的miRNA，miRNA*在特定脅迫中也發生了明顯的表達量變化，表明其參與非生物脅迫響應并發揮一定的作用，今后對于miRNA*的研究工作也將很有意義。miRNA在加工過程中會發生堿基替換、缺失或增加等修飾，這些修飾廣泛存在于多種作物中并可能參與調控作物的生長發育和逆境應答，研究miRNA的修飾將為理解miRNA的作用機制和功能提供新的思路。

3.3 植物miRNA參與逆境脅迫應答的分子機制

盡管很多研究揭示了miRNA與逆境脅迫的相關性，但關于miRNA對逆境脅迫調控的分子機理尚不清晰，且仍有大量與逆境相關的miRNA及其靶基因尚未被發現，同時一種miRNA可能具有多重作用，在多種非生物脅迫調控途徑中發揮作用，因此有必要深入發掘逆境相關 miRNA，揭示其靶基因，解析miRNA介導的逆境脅迫響應調控網絡，這些研究可豐富植物逆境生物學的理論知識，并為農作物的遺傳改良提供技術支撐，促進農業生產的可持續發展。

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