一株巨菌草內生細菌的鑒定及其促生特性初步分析

劉玉珍，鄧振山，高 飛，李 靜，李征霆，陳凱凱，魏婷婷

（延安大學生命科學學院，陜西 延安 716000）

植物內生菌是細菌或真菌定植在健康植物組織，屬于植物細胞或植物組織之間無明顯癥狀的疾病組織［1-2］。這些內生菌可以用它們的生命周期或其一部分入侵寄主植物的活組織而對被剝奪的植物不產生任何傷害，有時造成隱性感染和無癥狀［3］。值得一提的是，現存的大量植物物種是多數內生菌的宿主，但對這些植物的內生微生物尚未深入研究［4-5］。在與植物共生中，這些細菌是通過不同的途徑包括激素的產生、磷酸鹽等無機礦物的溶磷作用、大氣中氮的固定和鐵載體的產生來刺激植物生長［6-7］。植物內生菌的生物學特性，可發揮定殖于植物體內生細菌的促生和防病作用，為植物提供有效營養，促進植物生長［8-9］。近年來關于有多種生物學特性內生菌的報道陸續出現。姚玉玲等［10］從矮生嵩草體內分離到1株具有多種生物學特性的植物內生菌；姜云［11］等研究了1株人參內生菌的多種生物學特性。目前關于促生細菌的報道較多，但因其在實際應用中存在諸多問題如應用效果不穩定、易受土著微生物的影響、難以在土壤中成功定殖等，分離篩選植物內生促生細菌并加以應用已成為新的研究方向。

巨菌草（Pennisetumsp.）是指營養適合食用菌、藥用菌等微生物生長需要，太陽能利用率高，適應性強，具有某些優良特性，可作為食用菌、藥用菌等微生物培養基并有綜合開發利用價值的草本植物［12-13］。目前對于巨菌草內生促生細菌的研究鮮見報道。本試驗以巨菌草為研究對象，從中篩選具有促生作用的內生菌，研究測定其抑菌效果、固氮、溶磷、產鐵載體和分泌IAA的能力，通過16S rDNA鑒定該菌株的分類地位，以期為植物內生促生菌的開發和利用提供依據，也為巨菌草微生物菌肥的開發與應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集 2016年5月在陜西延安溫家溝巨菌草基地（35°31′55″N，109°31′22″E）采集完整巨菌草植株體，用無菌袋包裝帶回實驗室。延安屬高原大陸性季風氣候，平均海拔1000 m左右，年日照2818 h，年均無霜期170 d，平均氣溫9.2℃，年均降水量500 mm，土壤的物質組成主要以黃土為主。

1.1.2 主要試劑和儀器 PCR所用試劑均購自上海生工生物工程有限公司，其他化學試劑均為國產分析純。所用儀器包括UV-1780紫外可見分光光度計（蘇州島津儀器有限公司），HC-3614R高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司），HNZ-2-2F垂直流形超凈工作臺（南通滬南科學儀器有限公司），LS-75L型立式壓力蒸汽滅菌器（江陰濱江醫療設備廠），電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫療器械廠），LRH-250F生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司），FLY-2102恒溫振蕩器（上海風棱實驗設備有限公司）。

1.1.3 培養基與染液 PDA培養基、牛肉膏蛋白胨培養基、察氏培養基、水瓊脂培養基（瓊脂15～20 g，蒸餾水1000 mL，pH自然）、高氏I號培養基、NBRIP培養基、Ashby培養基。

100 mL CAS檢測固體培養基：20%蔗糖溶液1 mL，10%酸水解酪蛋白3 mL，1 mmol/L CaCl2100 μL，0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）0.5 mL，CAS染液5 mL，瓊脂粉1.8 g；CAS染液：稱取0.012 g CAS溶解于10 mL去離子水中，并與2 mL 1 mmol/L FeCl3混合，得a液；取0.015 g CTAB溶于8 mL去離子水中，得b液；a液與b液混合即得CAS染液。0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）100 mL：NaH2PO4·2H2O 0.5905 g，Na2HPO4·12H2O 2.427 g，NH4Cl 0.250 g，KH2PO4·3H2O 0.075 g，NaCl 0.125 g。

Salkowski’s試劑：1 mL 0.5 mol/L FeCl3溶解于49 mL 35% HClO4中。鉬銻抗試劑：將125 ml 2.5 mol/L硫酸與37.5 mL鉬酸銨溶液混合，加入75 mL抗壞血酸溶液和12.5 mL酒石酸梯鉀溶液，充分混勾（現用現混）。

1.2 試驗方法

1.2.1 巨菌草內生菌的分離、純化 采用組織塊分離法和劃線分離法對巨菌草植株體中的內生菌進行篩選，在超凈工作臺對材料表面進行消毒。選擇新鮮、健康巨菌草根、莖、葉，首先去掉表面的泥土等附著物，然后用自來水沖洗干凈，再用無菌水沖洗1次；于95%酒精中浸泡3～5 min后用無菌水沖洗3～4次，然后轉入含有效氯為5%的次氯酸鈉溶液中浸泡3～8 min，無菌水沖洗4～5次，最后用70%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗4～5次，在無菌條件下晾干備用；在無菌狀態下將材料切成0.2 cm×0.2 cm的小塊，每平板接2～4個組織，于28℃恒溫靜置培養3～5 d。待培養基中有可見菌落時，挑取周圍菌落移入相應培養基純化，并進行菌落形態描述，編號，置于4℃冰箱中備用。將最后一次沖洗的無菌水涂布于培養基上作為對照，于恒溫靜置培養，檢驗消毒效果［14-15］。

1.2.2 產IAA活性菌株的篩選 定性測定：將待測菌株接種于加入了色氨酸（1 g/L）的NA液體培養基，28℃ 180 r/min搖床震蕩培養3 d，于4℃ 12000 r/min離心后取100 μL上清液加入96孔板中，加入100 μL Salkowski’s試劑混勻，室溫下避光顯色30 min，然后進行觀察。能夠產生IAA的菌株菌懸液上清與Salkowski’s試劑混合會呈現紅色或者粉紅色，而色氨酸是黃色或者無顏色反應。

定量測定：制作標準曲線：配置濃度梯度為 0、5、10、20、40、60 mg/L的吲哚乙酸標準溶液。將1 mL各濃度標準溶液加入試管，再加入等體積Salkowski reagent比色液，避光放置30 min，以0 mg/L作空白對照，用紫外分光光度計在540 nm檢測吸光值，吸光值為縱坐標，IAA濃度為橫坐標，繪制標準曲線，據其得出的回歸方程為Y= 0.0157608X（R2= 0.9945）。之后，對能產生IAA的各菌株，在恒溫搖床內160 r/min 28℃培養48 h，12000 r/min離心10 min得到上清，取上清液2 mL加入2 mL Salkowski reagent比色液，暗處放置0.5 h后在540 nm下測定吸光值，并根據標準曲線計算菌液中的IAA濃度［16-17］。

1.2.3 菌株YA-6其他促生特性分析

（1）溶磷性的測定。定性測定：活化篩選出的內生細菌，培養36 h后，將其分別點接于NBRIP平板中心，每處理重復3次，28℃恒溫暗培養7～10 d，檢查菌落周圍是否有透明溶磷圈出現。出現透明圈，表示該菌株將難溶的磷轉化為可溶性憐，記為有溶磷活性，并測量記錄其溶磷圈大小。

定量測定：配置濃度梯度為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/L的標準溶液。將150 μL標準液、2550 μL去離子水和300 μL鉬梯抗試劑分別加入試管，混勻放置15 min，用紫外分光光度計在700 nm檢測吸光值，吸光值為縱坐標，磷酸二氫鉀濃度為橫坐標，繪制標準曲線，據其得出的回歸方程為Y= 0.121333X（R2= 0.98356）。將待測菌株接種于營養肉湯液體培養基中，置于28℃搖床過夜培養，取150 μL接種于15 mL NBRIP液體培養基中，3次重復，于28℃搖床振蕩培養10 d后，將培養液12000 r/min離心5 min，上清液用于磷含量測定。將150 μL上清液，2550 μL去離子水和300 μL鉬梯抗試劑分別加入24孔板中，混勻，15 min后在700 nm波長下測定吸光值，并根據標準曲線計算菌液中的磷濃度［18-19］。

（2）潛在固氮能力檢測。將待測菌株接種到NA液體培養基，28℃ 180 r/min搖床震蕩培養36 h 后，以100 μL/5 mL接種到Ashby液體培養基中，對照接種無菌水，每個處理3次重復，28℃靜置培養，7 d后對比接菌與對照的渾濁情況，明顯渾濁為陽性，即為有固氮活性。同時將培養36 h的菌株在Ashby固體培養基上劃線培養，28℃暗培養，連續繼代3次，每次培養7 d，第3次仍有明顯活性的菌株，記為具有固氮活性［20-21］。

（3）產鐵載體能力的測定。菌種接種于CAS液體培養基中，28℃、160 r/min恒溫培養2～3 d，觀察培養基顏色變化。顏色由藍色變為粉紅色，說明具有產鐵載體的能力，反之，則無產鐵載體的能力［22-23］。

（4）抑制病原真菌活性試驗。采用平板對峙法測定其抑菌活性。選取番茄枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、玉米大斑病菌作為指示菌，并于PDA培養基上活化。用0.5 cm打孔器在菌落邊緣打成菌餅，用接種環挑取1塊病原菌菌餅置于PDA平板中央，在距離病原菌菌餅2.5 cm處的3個點對稱接種待測內生細菌菌株，以僅接種病原菌的處理為對照，每個處理3重復，28℃下培養，觀察菌落的生長變化，直至指示菌的菌絲在對照平板上鋪滿培養基整個表面，以抑菌圈大小判斷抑菌作用。記錄、測定抑菌圈大小［24-25］。

1.2.4 菌株YA-6的鑒定 將純化后的菌株YA-6接種于牛肉膏蛋白胨培養基，置28℃恒溫箱中培養2 d后，觀察并描述菌落的形態特征，對菌體進行革蘭氏染色。

利用CTAB法提取菌株YA-6的基因組DNA進行PCR擴增，PCR擴增引物、反應體系及擴增程序參見文獻［26-27］。具有特異性條帶的擴增產物送至上海生工公司測序，將測得的序列與GenBank中的相關數據進行Blast相似性分析。然后用Mega 5.0的鄰接法（Neighbor-Joining）建立16S rDNA基因的系統進化樹，分析菌株的系統發育學特征，獲得GenBank登錄號。

2 結果與分析

2.1 巨菌草內生菌的分離

采用多種培養基對巨菌草植株體進行內生細菌分離，得到86株內生細菌，其中從葉中分離到34株，占分離總菌數的39.53%，從根中分離到28株，占分離總菌數的32.56%，從莖中分離到24株，占分離總菌數的27.91%。試驗表明，巨菌草植株體內存在豐富的內生細菌。

2.2 產IAA菌株的篩選

從86株內生菌中篩選到8株產IAA能力較好的菌株，其中YA-6產IAA能力最強，顯色液反應后呈現紅色，質量濃度達到11.73 mg/L。

2.3 菌株YA-6其他促生潛能的分析

Ashby培養試驗發現，菌株YA-6可以在Ashby培養基上正常生長，說明其具有潛在的固氮能力；溶解無機磷平板培養試驗能看到明顯的溶磷圈，說明其具有溶磷能力，鉬銻抗比色法測得其溶磷活性為7.103 mg/L；鐵載體試驗顯色液反應為粉紅色，說明菌株具有產生鐵載體的能力；但菌株YA-6不具有抑制病原菌的活性（圖1，封三）。

2.4 菌株YA-6的鑒定

2.4.1 形態特征觀察 菌株YA-6在牛肉膏蛋白胨培養基上形成的菌落呈淡黃色，不透明，不粘稠，邊緣整齊；通過光學顯微鏡觀察發現菌體呈桿狀，革蘭氏染色呈陽性。

2.4.2 分子鑒定 菌株YA-6的16S rDNA序列（登錄號：KY852302）與GenBank數據庫進行Blast比對分析，與其同源性較高的菌株均屬于假單胞菌屬，其中與Pseudomonas hunanensis同源性最高（99.36%），通過構建的系統進化樹也可以看出，菌株YA-6與Pseudomonas hunanensis聚于同一分支（圖2）。

圖2 菌株YA-616S rRNA基因片段序列系統發育分析

3 結論與討論

本試驗經分離、篩選得到86株巨菌草內生細菌，從86株巨菌草內生細菌中，篩選出8株具有產IAA能力的活性菌株，僅占9.30%。其中菌株YA-6產IAA能力最強，質量濃度達到11.73 mg/L，與姜云等［11］的報道基本一致，表現極高的產IAA能力。菌株YA-6在NBRIP固體培養基上能夠形成明顯的溶磷圈，采用定量測定溶磷能力達7.103 mg/L，表明其對無機磷具有溶解能力，但低于姚玉玲等［10］的研究結果。測定菌株YA-6溶磷能力時發現培養液的PH較空白培養液 pH值有所降低，可推測產生有機酸是菌株YA-6溶磷的一種方式，但具體的溶磷機制還有待進一步研究。菌株YA-6能夠使CAS液體培養基由藍色變為粉紅色，說明其具有產生鐵載體的能力。菌株YA-6經無氮培養基定性測定呈陽性，說明其具有固氮能力，對宿主巨菌草的環境適應性及生長方面具有一定利用價值。經生理生化、分子鑒定及系統發育分析，初步鑒定YA-6為假單胞菌屬。

植物內生細菌對植物生長無害，不僅可以顯示植物生長的潛力，而且有利于植物增強共生環境，可能通過IAA的產生、固氮、磷酸鹽溶解和鐵載體的產生來影響植物的生長［28-29］。植物內生細菌因其具有多種有益生物學作用，已成為國內外研究的熱點。許多過去的研究表明［30-31］，促進不同植物生長的細菌能產生IAA，植物根部含有色氨酸，可被植物內生細菌作為生產IAA的前體，因此，IAA量化被認為是描述植物內生促生細菌的共同特征。磷，是一種限制植物生長的營養物質，但由于固定機制，植物通常無法獲得。植物通過酸化、螯合、交換反應和有機酸產生的過程中，溶磷菌可以改變不溶性磷酸鹽成可溶性形式；植物內生細菌最重要的一個磷酸溶解機制是低分子量有機酸的產生導致土壤的酸化［32-33］。植物內生固氮菌是定殖于植物體內與宿主植物進行聯合固氮的一類微生物，不但具有固氮作用還有生物防治促進植物生長的作用。20世紀80年代以來，內生固氮菌由于在禾本科作物上具有固氮活性，又能促進植物生長，成為國內外研究的熱點［34-35］。內生菌能產鐵載體對植物來說是有利的，因為它是通過抑制植物病原體來促進植物生長的機制之一；鐵載體有能力從染料復合體中帶走鐵，從而導致顏色由藍色變為橙黃色［36］。

菌株YA-6經16S rDNA測序，屬于假單胞菌屬，具有多種促生潛能，有望開發為促生菌株，該試驗還需要進一步的研究。關于假單胞菌在促生長方面的研究和報道已有很多，該屬菌株具有一定溶磷特性，能促進植物對磷元素的利用，還能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，對污水和土壤污染治理效果明顯［37］。巨菌草內生菌YA-5具有分泌IAA、溶磷、固氮和產鐵載體等生物學功能，為進一步開發和利用植物的內生促生菌提供了依據，也為開發經濟環保的生物菌肥提供菌種資源。

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