廣東火龍果果柄腐爛病病原菌的分離及鑒定

雷夢英，楊曉朱，李落葉，匡蓉琳，李馥純，莫介羽，黃少彬

（廣東生態工程職業學院，廣東 廣州 510520）

火龍果屬仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus）植物，原產于墨西哥、巴西、古巴、尼加拉瓜等中美洲的熱帶雨林和沙漠地區，后經人工栽培遍及美國南部以及越南、菲律賓、泰國等東南亞國家，在我國海南、廣東、廣西、貴州、福建、云南和臺灣地區也有種植［1-4］。火龍果是熱帶水果中少有的涼性水果，富含水溶性膳食纖維、花青素、維生素等，具有抗癌和預防高血壓的功效［5-6］。

火龍果高產、早產，經濟價值高，是近年來新興的熱帶水果之一。目前國內火龍果的主要栽培品種為紅皮紅肉和紅皮白肉兩種類型，而種植紅肉品種的經濟效益最佳［7-8］。隨著火龍果種植面積不斷擴大，其病害發生也逐漸加重。據報道，火龍果莖干病害有瘡痂病、莖腐病、枯萎病、莖枯病、潰瘍病、枯斑病、基腐病和病毒病等［9-11］。火龍果果實病害主要有由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、單隔鐮刀菌（F.dimerum）、桃吉爾霉（Gilbertella persicaria）、仙人掌平臍蠕孢（Bipolaris cactivora）等引起的火龍果果實腐爛病［12-14］，以及由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的炭疽病在火龍果的莖干和果實上均可發病［15］。

我們在廣東省廣州市從化區一火龍果種植基地發現了一種火龍果新病害，命名為火龍果果柄腐爛病。病原菌通過危害火龍果果柄，影響其商品價值。火龍果果柄腐爛病的癥狀與已報道的火龍果病害癥狀存在明顯差異，目前尚未有對該病害病原菌系統研究的報道。鑒于此，我們對該病害的病原菌進行了分離和純化培養，根據病原菌的菌落形態、分生孢子形態特征，同時結合rDNA-ITS序列和系統發育樹分析對該病原菌進行鑒定分析，明確火龍果果柄腐爛病的病原菌種類，以期為該病的防治研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試紅肉火龍果于2017年7月20日購自廣東省廣州市從化區溫泉鎮一火龍果種植基地，采摘后直接運往實驗室，室溫存放，觀察發病情況。

馬鈴薯葡萄糖固體培養基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15 g，水1000 mL；修改的Bilay培養基：磷酸二氫鉀1 g，硝酸鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，淀粉0.2 g，葡萄糖0.2 g，蔗糖 0.2 g，瓊脂 15 g，水 1000 mL。

1.2 病原菌分離

在感染腐爛病的火龍果果柄病健交界處切取大小為2～3 mm×2～3 mm的組織塊。表面消毒后于70%酒精浸泡消毒1 min，無菌水沖洗1次。2%次氯酸鈉溶液浸泡消毒1 min，無菌水沖洗3次，將組織塊置于無菌吸水紙上晾干。將消毒處理的組織塊置于PDA固體培養基上，培養基中加入終濃度為50 μL/mL的硫酸鏈霉素以抑制細菌生長。25℃光照和黑暗交替培養2 d后，用滅菌的接種針挑取菌落邊緣菌絲轉入PDA平板培養基上進行純化培養。

1.3 病原菌單孢分離純化

用滅菌水沖洗病原菌菌落，以兩層無菌擦鏡紙過濾除去菌絲，配制成濃度為1.0×104個/mL的孢子懸浮液。取10 μL孢子懸浮液均勻涂布在PDA培養基上。25℃光照和黑暗交替培養，待由單個孢子形成的菌落長出后，挑取菌落邊緣菌絲轉移至新的PDA培養基上純化培養。純化的菌株接種在PDA試管斜面上，于4℃保存備用。

1.4 病原菌的柯赫氏法則驗證

將分離獲得的病原菌在PDA平板上25℃光照和黑暗交替培養7 d，制備孢子懸浮液，無菌水稀釋至1.0×106個/mL。將健康無傷口的火龍果在2%次氯酸鈉溶液浸泡3 min，蒸餾水沖洗3次后在超凈工作臺上晾干。將10 μL孢子懸浮液接種于火龍果果柄處，放入塑料盒中。接種等量無菌水作為空白對照。每個處理接種10個果實。取發病的火龍果，按照1.2的方法重新分離病原菌，并與原接種病原菌進行菌落形態、顏色比較，如果重新分離獲得的病原菌與原接種病原菌一致即確定其為火龍果果柄腐爛病的病原菌。

1.5 病原菌形態觀察和鑒定

將保存的菌株接種到PDA平板上，25℃活化培養3 d。使用無菌手術刀在菌落邊緣切取菌絲塊（5 mm×5 mm），分別轉接到新的PDA平板和修改的Bilay培養基平板上，25℃光照和黑暗交替培養，記錄菌落的形態特征包括菌落顏色、大小等。無菌接種針挑取培養7 d的菌落，制備臨時玻片觀察病原菌顯微特征。依據菌落培養特征，以及分生孢子形態、顏色和大小等特征，參照布斯（Booth）鐮刀菌分類系統［16］對分離獲得的病原菌進行形態學鑒定。

1.6 病原真菌的分子生物學鑒定及分析

利用真菌通用引物擴增病原菌基因組中的保守rDNA-ITS序列，為病原菌種類的鑒定提供分子依據。

基因組DNA提取：將病原菌菌株接種于PDA平板上，25℃光照和黑暗交替培養7 d。刮取約0.1 g菌絲體，于液氮中研磨成粉末。使用AxyPrep基因組DNA小量試劑盒提取基因組DNA。

rDNA-ITS序列擴增及分析：以提取的病原菌菌株的基因組DNA為模板，使用真菌通用引物 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'），按以下條件擴增其rDNA-ITS序列。50μL PCR擴增體系如下：10×PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，10 μmol/L ITS4 和 ITS5引物各 1 μL，病原菌 DNA 2 μL，5 U/μL的ExTaqDNA聚合酶0.5 μL。PCR擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性40 s、56℃退火40 s、72℃延伸1 min，共35個循環；72℃再延伸10 min；4℃保存。取5 μL PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳（110 V，30 min）檢測確認目的片段大小后，使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收純化。回收純化產物委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。采用BLAST程序將獲得的測序結果在美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫中進行同源比對分析，對病原菌進行分子水平鑒定。從NCBI網站數據庫中下載病原菌rDNA-ITS序列的同源序列及其近緣種序列。用Clustal x 2.0軟件進行多重序列比對后，用Mega 7.0系統發育軟件采用鄰近法（neighbor-joining）構建系統發育樹。依據分支的支持率，確定其系統發育關系。

2 結果與分析

2.1 癥狀描述

火龍果果實室溫存放5 d后，其腐爛病發病最為嚴重。此外，還發現一種為害火龍果果柄的腐爛病（圖1A，封三），命名為火龍果果柄腐爛病。該病發病率較低（5%左右），影響火龍果的外觀和商品價值。其典型癥狀為果柄處有白色菌絲。挑取白色菌絲顯微觀察，發現存在少量的鐮刀菌（Fusariumsp.）大型分生孢子，初步推斷該病原菌為一種鐮刀菌（Fusariumsp.）。

2.2 病原菌柯赫法則驗證

火龍果果柄腐爛病病原菌經單孢分離，共獲得純化菌株15株（A1～A15）。除菌株A5和A12外，其他13株的菌落形態完全一致，隨機選取菌株A11作為代表菌株用于后續研究。運用柯赫法則分別將菌株A5、A11和A12接種于健康火龍果的果柄處，結果發現菌株A5和A12接種7 d后，仍無明顯癥狀。而菌株A11接種3 d后火龍果果柄處可見明顯的白色菌絲，接種7 d后的癥狀與火龍果果柄腐爛病的癥狀相符合（圖1B、C，封三）。從接種火龍果的發病部位分離到與菌株A11菌落培養性狀、分生孢子形態一致的病原菌，符合柯赫氏法則。由此確定病變組織分離獲得的這種鐮刀菌是火龍果果柄腐爛病的致病病原菌。

2.3 病原菌培養性狀與形態特征

病原菌菌株A11在PDA培養基上的菌落呈圓形，生長旺盛，生長速率為13.5 mm/d（圖2A）。氣生絮狀菌絲初期呈白色，后期產生橙黃色大孢子堆。培養基平板背面顏色初期為白色，后變為黃褐色，最后變成深棕色。病原菌在修改的Bilay培養基上生長速率為18.7 mm/d（圖2B），氣生菌絲少，白色。大型分生孢子從瓶狀小梗上產生，孢子量多。未觀察到小型分生孢子。大型分生孢子鐮刀狀，略微向內彎曲，3～6個隔膜（多為3～5個，圖2C）。根據病原菌菌落形態和大型分生孢子特征，參照布斯（Booth）鐮刀菌分類系統［16］，初步鑒定火龍果果柄腐爛病原菌為木賊鐮刀菌（F. equiseti）。

2.4 病原菌rDNA-ITS分子鑒定

采用rDNA-ITS分子鑒定將分離獲得的病原菌鑒定到種。以分離獲得的病原菌菌株A11、A13和A15的基因組DNA為模板，使用真菌通用引物ITS4和ITS5擴增獲得它們的rDNAITS序列（圖3）。測序結果表明病原菌菌株A11、A13和A15的rDNA-ITS序列完全一致，序列長度約為540 bp。將病原菌菌株A11序列在NCBI上進行BLAST比對，發現該病原菌菌株的rDNA-ITS序列與登錄號為HM008677的木賊鐮刀菌（F. equiseti）rDNA-ITS序列的同源性最高，為100%，比對覆蓋率（query cover）為99%，E值為0。綜合形態學鑒定結果和rDNAITS序列比對結果，最終確認引起火龍果果柄腐爛病的病原菌為木賊鐮刀菌。

圖2 火龍果果柄腐爛病原菌菌落特征和分生孢子形態

圖3 火龍果果柄腐爛病原菌rDNA-ITS序列的PCR擴增結果

2.5 病原菌系統發育分析

基于rDNA-ITS基因的堿基序列，以鏈格孢菌（Alternaria alternata）的rDNA-ITS序列（FJ618522.1）為外圍樹根，采用鄰接法（NJ）構建了8株鐮刀菌屬的系統發育樹（圖4）。發現鐮刀菌屬存在明顯的屬內遺傳差異，其中引起火龍果果柄腐爛病的木賊鐮刀菌與梨孢鐮刀菌（F. poae）、禾谷鐮刀菌（F. graminearu）和擬枝孢鐮刀菌（F. sporotrichioides）的遺傳關系較近，其支持率高達99%。而木賊鐮刀菌與串珠鐮刀菌（F. proliferatum）和茄腐鐮孢菌（F.solani）的遺傳關系較遠。

圖4 基于rDNA-ITS序列的系統發育樹

3 結論與討論

火龍果是近年發展起來的熱帶和亞熱帶水果之一，具有較高的營養價值和保健功能。火龍果高產、早產，種植技術要求不高，市場需求大且價格好，具有十分可觀的發展前景［7］。但火龍果種植地區氣溫高，濕度大，隨著火龍果種植面積的不斷擴大，病害問題日益嚴重［9］。

鐮刀菌屬（Fusarium）又稱鐮孢菌屬，普遍存在于土壤和有機體內，兼寄生或腐生生活。其中尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和單隔鐮刀菌（F. dimerum）均可引起火龍果果實腐爛病的發生［12］。鐮刀菌屬菌種資源繁多，形態特征復雜。本研究以傳統形態學特性鑒定為基礎，結合rDNA-ITS基因序列同源性分析，最終確定火龍果果柄腐爛病的病原菌為木賊鐮刀菌。已有研究表明木賊鐮刀菌作為弱致病菌，能侵染多種植物的種子、根系、塊莖和果實，引起剛竹稈褐腐病、黃蜀葵莖枯病、辣木枝枯病、櫻桃采后軟腐病等，感病植株枝葉枯黃脫落，枯萎死亡［17-20］。此外，木賊鐮刀菌也可與鐮刀菌屬等其他病原菌通過復合侵染，引起玉米穗腐病、苜蓿根腐病、向日葵枯萎病等［21-23］。

火龍果果柄腐爛病屬首次發現，盡管尚未發現其對火龍果可食部分造成危害，但對火龍果外觀品質存在潛在的影響。對于火龍果果柄腐爛病，除了進一步了解其發生特點和流行規律，還需要明確木賊鐮刀菌的生物學特性及其對殺菌劑的敏感性，為火龍果果柄腐爛病的綜合防治提供理論依據。

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