溫針灸對膝骨關節炎SD大鼠軟骨中TNF-α和MMP-3的影響

宋昳星，郭冬梅

(新疆醫科大學附屬中醫醫院，新疆 烏魯木齊 830000)

膝骨關節炎是一種以疼痛為早期表現，隨著時間的延長，可以出現關節僵硬、腫脹以及屈伸功能異常，并最終導致關節變形、行走功能喪失的慢性退行性疾病。該病的發病機制尚不明確，其中年齡、運動習慣、體質量以及遺傳等因素均與其發生和發展有關[1]，而軟骨的退行性改變是該病發生的核心所在，且炎癥細胞因子損傷機制逐漸受到重視[2]。炎癥細胞因子主要包括腫瘤壞死因子、基質金屬蛋白酶、白細胞介素以及一氧化氮等，目前對腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)的研究最多，前者主要由單核吞噬細胞產生，對軟骨細胞具有較強的分解作用，可抑制軟骨基質合成[3]；后者在正常生理狀態下主要以基質蛋白酶原的形式存在，但在膝骨關節炎患者中，其被過度激活，導致軟骨細胞外基質蛋白分解酶過度激活，從而加速了軟骨的分解和代謝，加速軟骨損傷[4]。目前西醫多以對癥治療為主，早期主要以患者教育、功能鍛煉為主，中期主要以鎮痛、消炎為主，后期則主要以關節腔注射藥物、腔鏡手術為主[5-6]。中醫將本病歸為“痹證”“筋痹”“骨痹”的范疇，治療上有方藥內治、方藥外治以及針灸治療等方法，其中針灸療法作為中醫外治的主要方法，具有操作簡單、療效確切、價廉的特點，非常適合本病的早期治療[7]，但作用機制不明確。本研究通過動物實驗，觀察了溫針灸對膝骨關節炎SD大鼠行為學以及軟骨中TNF-α和MMP-3的影響，旨在為該病的臨床治療提供依據。

1 實驗資料

1.1實驗動物 清潔級雄性SD大鼠90只，體質量200～250 g，由山東中醫藥大學動物實驗室提供，合格證號：SCXK(魯)2014-0025。所有動物飼養于我院實驗動物實驗室，飼養溫度保持在(22±2)℃，濕度(60±10)%，敏感周期為12 h。自由攝水，標準飼料適應性喂養1周。

1.2主要試劑和儀器 水合氯醛(廣州化學試劑廠，批號：20160223-3)；蘇木精染料(天津化學試劑廠，批號：20160305-6)；甲醛(北京普博欣科技有限公司，批號：20150105-6)；二甲苯(天津化學試劑廠，批號：20160316-1)；TNF-α試劑盒(美國Sigma公司生產，購自北京定國化學生物技術有限公司，批號：LOT#035M1523V)；MMP-3試劑盒(美國Sigma公司生產，購自北京定國化學生物技術有限公司，批號：LOT#113M3652V)；離心機(德國制造，型號：5810R)；石蠟包埋機(浙江金華益迪制造，型號：YD62)；切片機(美國制造，型號：RM2235)；760日立全自動生化儀(日本制造)；放射免疫測量儀(中國制造，型號：SN-682)。

1.3分組、造模及干預 將喂養1周后SD大鼠隨機分為正常組、模型組和針灸組，每組30只。模型組和針灸組大鼠參照文獻[8]采取關節腔注射木瓜酶法復制右膝關節炎模型，并于造模后第4周測量左右膝關節厚度，若右膝關節較左側腫脹大于20%，則視為造模成功。本實驗中大鼠全部造模成功。然后針灸組給予溫針灸治療，選取血海、陽陵泉、內膝眼為主穴，穴位位置參照《實驗針灸學》[9]。血海位于右后肢髕骨底與髕骨內側連線上方約0.8 cm處；陽陵泉位于腓骨頭下方凹陷處；內膝眼位于后肢髕骨下方，髕骨韌帶內側凹陷處。針刺前，大鼠板固定后進行穴位定位，采用太和牌0.22 mm×0.25 mm一次性針灸針，每穴刺入3～5 mm，采用平補平瀉手法上下提插5次后，于針柄處粘貼一蠶豆大艾柱后點燃，持續10 min，連續針灸2周。正常組和模型組大鼠不給予任何干預。

1.4觀察指標

1.4.1大鼠行為學表現 干預前后采用改良版Lequesne MG量表評估大鼠行為學表現，主要評估內容包括大鼠局部疼痛度、步態、關節腫脹情況以及關節活動范圍。疼痛程度：無疼痛記0分；患肢出現收縮記1分；患肢收縮同時伴有輕度全身反應記2分；患肢聚類收縮，伴有全身顫抖甚至掙扎記3分。步態：大鼠正常行走記0分；輕度跛行，觸地有力記1分；患肢參與行走，但跛行明顯記2分；患肢不能參與行走記3分。關節腫脹程度：無腫脹記0分；輕度腫脹，骨性標記線變淺記1分；重度腫脹，骨性標記線消失記2分。關節活動范圍：90°以上且無明顯疼痛反應記0分；45°～90°且無明顯疼痛反應記1分；15°～45°且無明顯疼痛反應記2分；<15°且無明顯疼痛反應記3分。

1.4.2大鼠軟骨組織中TNF-α和MMP-3含量實驗結束時采用空氣栓塞法將所有大鼠處死后固定于手術臺，將右后肢伸直以固定膝關節，備皮后剝離皮膚及皮下組織，暴露膝關節后，使用眼科剪與小刀片切取膝關節面軟骨約20 mg，生理鹽水沖洗干凈后分為2份，一份標本放置于4%的甲醛中固定進行HE染色切片；另一份放置于1.5 mL試管中加入5 mL生理鹽水，離心取上層清液，按照TNF-α和MMP-3試劑盒說明書，采用放射免疫法檢測TNF-α和MMP-3含量。

2 結 果

2.13組大鼠干預前后Lequesne MG評分比較干預前，模型組和針灸組Lequesne MG評分均顯著高于正常組(P均<0.05)。干預結束后，模型組和針灸組評分均顯著下降(P均<0.05)，且針灸組評分明顯低于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠干預前后Lequesne MG評分比較分)

注：①與正常組比較，P<0.05；②與干預前比較，P<0.05；③與模型組比較，P<0.05。

2.23組大鼠膝關節組織病理學表現 正常組大鼠膝關節組織未發現病理改變，關節軟骨表面光滑完整，各層軟骨細胞排列緊密有序，見圖1；模型組大鼠膝關節面粗糙不平，部分地方出現病理性裂隙，中間可見壞死性軟骨組織，周圍可見增生細胞及炎癥細胞，見圖2；針灸組大鼠膝關節病變范圍小于模型組，其水腫程度、炎癥浸潤及壞死程度均輕于模型組，少數壞死組織區內可見新生的軟骨細胞和纖維組織，見圖3。

圖1 正常組大鼠膝關節組織鏡下表現

圖2 模型組大鼠膝關節組織鏡下表現

圖3 針灸組大鼠膝關節組織鏡下表現

2.33組大鼠膝關節組織中TNF-α、MMP-3含量比較 模型組及針灸組大鼠膝關節組織中TNF-α、MMP-3含量均明顯高于正常組(P均<0.05)，但針灸組TNF-α、MMP-3含量均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠膝關節組織中TNF-α、MMP-3含量比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

3 討 論

目前膝骨關節炎的動物模型有很多，然而由于膝骨關節炎的發病機制十分復雜，多種因素均參與其中，故現有的動物模型均很難模擬膝骨關節炎的發病全過程，只是模擬了其中的一點或者一段過程[10]。木瓜蛋白酶可以使軟骨基質中的多種蛋白進行分解，使蛋白多糖從軟骨基質中丟失，激活骨關節的炎癥反應，造成類骨關節炎的病理狀態，故木瓜蛋白酶造模是目前常用的膝骨關節炎造模法之一，且成功率較高[11-12]。本研究也采用該法造模，結果均造模成功。

中醫認為膝骨關節炎病因主要為肝腎不足，氣血虧虛，適逢外感風寒或跌打損傷等，導致局部經絡不通，不通則痛，故在治療上宜滋補肝腎、溫經通絡[13]。《黃帝內經》中有云“腧穴所在，主治所及”，故本研究中取血海、陽陵泉、內膝眼三穴以疏通局部經絡，恢復關節內環境平衡。血海為足太陰脾經之穴，具有滋補脾腎、益氣活血之功效，為“治血要穴”，臨床上常用來疏通局部經絡，濡養關節，達到通則不痛、榮則不痛的目的；陽陵泉屬于足少陽膽經，為八會穴之一的“筋會”，“膝為筋之府”，故選取此治筋穴以治骨病；內膝眼為治療骨痹之經驗用穴，常配合外膝眼進行透刺，但因大鼠膝關節較小難以操作，故單用此穴以促進膝關節周圍氣血的運行。《素問·痹論》中有“痛者，寒氣多也”，提示疼痛的發生多與寒氣侵蝕有關。而溫針灸是一種將針刺和艾灸結合的治療方法，具有溫經散寒、通絡止痛的雙重作用，因此常被用來治療膝骨關節炎[14-16]。本研究結果顯示，干預結束后，模型組和針灸組Lequesne MG評分顯著下降，且針灸組明顯低于模型組。進一步病理觀察發現，正常組大鼠膝關節組織未發現病理改變；模型組大鼠膝關節中可見廣泛的病理性改變；針灸組大鼠膝關節病變范圍少于模型組，且水腫程度、炎癥浸潤及壞死程度均輕于模型組，少數壞死組織區內可見新生的軟骨細胞和纖維組織。上述結果提示溫針灸不僅可改善膝骨關節炎的臨床癥狀，而且可減輕骨關節病理改變，這與文獻[17]報道相一致。

細胞因子在人體中是一種免疫調節因子，在人體各項功能中發揮著重要作用。在膝骨關節炎中，軟骨細胞異常分泌了多種細胞炎癥因子，這些因子被釋放至細胞外基質，導致基質細胞內代謝平衡被打破，抑制軟骨細胞生成的同時加速了軟骨細胞的凋亡。本研究結果顯示，模型組及針灸組軟骨組織中TNF-α、MMP-3含量均明顯高于正常組，但針灸組TNF-α、MMP-3含量均明顯低于模型組。提示溫針灸可能通過降低軟骨細胞中TNF-α、MMP-3含量，從而起到治療本病的作用。

綜上所述，溫針灸可以改善膝骨關節炎SD大鼠軟骨形態，具有改善軟骨退變和保護軟骨的作用，可能是通過降低軟骨細胞中炎癥因子TNF-α、MMP-3含量來實現的。然而本次實驗僅僅測定了實驗結束后的TNF-α、MMP-3含量，未能對上述指標進行動態監測，溫針灸治療膝骨關節炎的作用機制有待進一步探討。

[]

[1] 申延清，劉風霞，曹紅，等. 膝骨關節炎患者的臨床表現及相關影響因素[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2011,15(9)：1643-1646

[2] Johnson VL，Hunter DJ. The epidemiology of osteoarthritis[J]. Best Pract Res Clin Rheumatol,2014，28 (1)：5-15

[3] 陳益丹，邱華平，金肖青，等. 針刺對膝骨關節炎模型兔血清白介素-1β、腫瘤壞死因子-α的影響[J]. 上海針灸雜志，2010，29(7):468-470

[4] 周景輝，李石勝，吳耀持，等. 長針透刺膝骨關節炎模型大鼠滑膜組織中基質金屬蛋白酶3的變化[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2011，15(50):9415-9418

[5] Spaans AJ,van Minnen LP,Kon M,et al. Conservative treatment of thumb base osteoarthritis: A systematic review[J]. J Hand Surg Am，2015，40(1)：16-21

[6] 張軍，杜海軍，陳軍，等. 玻璃酸鈉注射治療膝關節退行性骨關節病的療效觀察[J]. 吉林醫學，2013,34(23):4734-4735

[7] 王麗紅，何英. 中西醫治療骨關節炎的研究進展[J]. 中國老年學雜志，2011，31(10)：1923-1926

[8] Kopp S，Mejersjo C，Clemenssson E. Induction of osteoarthritis in the guinea pig knee by papain[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol，1983，55(3)：259-266

[9] 李忠仁. 實驗針灸學[M]. 北京：中國中醫藥出版社，2013:327

[10] 謝希，高潔生. 骨關節炎動物模型研究進展[J]. 醫學綜述，2005,11(1):67-69

[11] Havdrup T，Telhag H. Papain-induced changes in the knee joints of adult rabbits[J]. Acta Orthop Scand,1977,48(2)：143-149

[12] 韓冠英，凌沛學，王鳳山，等. 不同濃度木瓜蛋白酶建立兔膝骨關節炎模型的比較研究[J]. 中國骨傷,2012,25(5)：424-429

[13] 王建國，何麗娟. 溫針灸治療膝骨關節炎療效觀察[J]. 中國針灸，2007，27(3)：191-192

[14] 劉立安，馬春燕，姜文. 溫針灸治療老年性膝骨關節病的臨床觀察[J]. 中國針灸，2003，23(10)：579-580

[15] 李俐，洪昆達，吳明霞，等. 溫針灸治療陽虛寒凝型膝骨性關節炎40例[J]. 福建中醫藥，2010,41(5)：36-37

[16] 丁明暉，張宏，李燕. 溫針灸治療膝關節骨性關節炎：隨機對照研究[J]. 中國針灸，2009,29(8)：603-607

[17] Nelson AE，Allen KD，Golightly YM，et al. A systematic review of recommendations and guidelines for the management of osteoarthritis:The chronic osteoarthritis management initiative of the U.S.bone and joint initiative[J]. Semin Arthritis Rheum，2014，43(6)：701-712