醒腦靜注射液對顱腦外傷大鼠腦細胞凋亡及相關凋亡蛋白影響的研究

趙軍蒼，王獻明，張瑩瑩，郭宏盛

(河北省邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056001)

顱腦外傷是急診外科常見的急危重癥，其中70%～80%是交通事故造成的，另一部分是意外傷害導致的。顱腦外傷是目前青壯年死亡和致殘的主要原因，也是備受社會關注的公共衛生問題。依據顱腦外傷發生的時間先后，可將其分為原發性和繼發性。原發性顱腦外傷是指創傷發生的瞬間，暴力直接作用于腦組織所造成的機械損傷；繼發性顱腦外傷是損傷發生數小時后，由于腦組織缺氧、缺血、水腫、大量自由基生成、炎性遞質釋放、凋亡蛋白基因過度表達等因素導致的。繼發性顱腦外傷不僅在腦損傷的發病機制中占有重要地位，而且對患者預后有很大影響。細胞凋亡是由基因控制的、細胞自主有序的死亡，它涉及一系列基因的激活、表達及調控[1]。近年來研究表明，細胞凋亡是繼發性顱腦外傷主要的細胞死亡方式，腦外傷后，各種刺激信號可導致多種病理生理因子的表達，通過多種途徑誘導神經細胞凋亡[2]。目前，顱腦外傷抗細胞凋亡治療的研究仍處于初始階段，大部分只限于基礎實驗。醒腦靜注射液是一種復方中藥制劑，已經開始用于顱腦外傷的臨床治療，并顯示出一定的療效。本實驗通過建立SD大鼠顱腦外傷模型，觀察了腦組織細胞凋亡情況及醒腦靜注射液對腦細胞凋亡的影響，旨在為顱腦外傷的臨床治療探索新的思路和方法。

1 實驗資料

1.1實驗動物 SPF級健康成年SD大鼠108只(雌雄不拘)，體質量250～300 g,由河北醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(冀)2016-0004。

1.2材料及試劑 醒腦靜注射液(無錫濟民可信山禾藥業股份有限公司生產，國藥準字Z32020563)；SABC免疫組化染色試劑盒、兔抗鼠Fas多克隆抗體、兔抗鼠Fas-L多克隆抗體、兔抗鼠Caspase-3多克隆抗體(均購自南京建成生物工程研究所)；原位末端標記(TUNEL)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司生產)。自由落體顱腦損傷器具、離心機、XSZ-4顯微手術電鉆、-85 ℃超低溫冰箱、彩色病理圖文分析系統、電熱恒溫水箱等。

1.3分組、造模及干預 將108只SD大鼠按隨機數字表法分成假手術組、損傷組、醒腦靜組，每組36只。損傷組和醒腦靜組采用Feeney’s自由落體腦損傷裝置造模，該裝置由支架、撞擊桿、下落擊錘三部分組成。大鼠乙醚麻醉后，剪去頭部皮毛，俯臥位固定于平臺上，用碘伏消毒頭頂皮膚，將頭皮沿正中線矢狀切開，用止血鉗分離皮下組織和骨膜，充分暴露顱骨前囟區域，以中線旁2.5 mm、矢狀縫后1.5 mm為中心，用手術電鉆磨一直徑約5 mm骨窗，注意止血，避免損傷硬腦膜并保持其外形完整。將撞擊桿的頭端對準骨窗，用質量為50 g的擊捶從30 cm處自由落下打擊骨窗，保持硬膜完整，造成嚴重的腦損傷，隨后用骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。假手術組僅做頭皮切開、顱骨開窗和清創縫合處理。醒腦靜組在腦打擊后5 min內腹腔注射醒腦靜20 mL/kg，假手術組和損傷組大鼠注射等量0.9%氯化鈉溶液，均每天1次，直至取標本。造模完成后，把大鼠放入飼養籠內，隔離喂養，避免清醒后相互撕咬，并放置充足的水源和食物。

1.4取材及樣品制備 在實驗第1，3，5，7，14，21天清晨，每組各隨機取出6只空腹大鼠，行乙醚麻醉后，處死并置于冰上取出全腦組織， PBS緩沖液沖洗，4%中性甲醛固定，保存于4 ℃冰箱，選取挫傷周圍區域約5.0 mm的腦組織石蠟包埋，連續切片，層厚5.0 μm，以備HE染色、免疫組化染色及TUNEL染色。

1.5腦組織病理觀察 選取HE染色切片進行光鏡下觀察。

1.6腦組織中Fas、Fas-L、Caspase-3蛋白表達檢測 嚴格按照SABC試劑盒操作說明進行免疫組化染色：取出大鼠腦組織石蠟切片，平鋪于多聚賴氨酸玻片，在60 ℃的恒溫箱內固定1 h，室溫下3%H2O2孵育10 min，滅活內源性過氧化物酶的活性，高壓抗原熱修復，羊血清工作液封閉，滴加兔抗鼠一抗工作液，4 ℃ 孵育過夜，PBS液沖洗3次×5 min，滴加適量生物素標記二抗工作液，37 ℃孵育30 min，PBS液再次沖洗3次×5 min，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min,PBS沖洗3次×5 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑反應染色，自來水充分沖洗。從每組選取切片5張，每張切片任意選取10個完整并且不重疊的高倍視野。結果判定：以細胞核和/或細胞質出現棕黃色顆粒或斑片為陽性細胞，用光學顯微鏡觀察并拍照，并采用Image-Pro Plus(IPP)7.0圖像分析系統測定各個視野內的平均吸光度值，然后進行統計學處理。

1.7腦細胞凋亡檢測 采用TUNEL法標記，嚴格參照說明書操作：將含有脫氧核苷酸末端轉移酶(TdT)的TUNELⅠ液和生物素標記X-dUTP的TUNELⅡ液，按1∶9混合并搖勻，每玻片滴50 μL，常溫下孵育30 min，在TdT的作用下，生物素標記X-dUTP被給合至凋亡細胞DNA斷裂后形成3’-OH末端，然后把辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素結合到X-dUTP上，最后加入底物，通過DAB顯色劑顯色。結果判定：細胞核出現棕黃色或棕紅色顆粒為陽性細胞，每張切片隨機選取5個完整不重疊的視野，在10×40倍熒光顯微鏡下觀察，采用MoticMed6.0圖像分析系統進行處理，計算出陽性細胞平均積分光密度值。

2 結 果

2.13組大鼠腦組織病理學變化 假手術組變化不明顯，光鏡下觀察可見腦組織形態結構均正常，細胞質和細胞核清晰可見，細胞結構完整，排列有序，無充血、水腫、空泡變性、壞死以及膠質細胞增生等情況發生。損傷組損傷第1天光鏡下見大腦皮質表面不連續，細胞排列紊亂，形態結構異常，胞質腫脹、結構不清，隨著時間延長，細胞損傷逐漸加重，細胞結構更加紊亂，胞質出現空泡變性，線粒體受損嚴重，粗面內質網顆粒脫落，細胞核溶解、破裂，上述變化以第5天最重，見圖1；14 d以后細胞水腫逐漸減輕。醒腦靜組腦組織病理結構損傷明顯減輕，第3天腦組織細胞輕度水腫；第5天胞核固縮，細胞內雖有空泡變性、線粒體損傷，但較損傷組明顯減輕，見圖2。

2.23組大鼠腦組織中Fas、Fas-L和Caspase-3蛋白表達情況 假手術組中，Fas、Fas-L和Caspase-3蛋白在腦細胞中多不表達或微弱表達；損傷組和醒腦靜組中，Fas、Fas-L和Caspase-3蛋白主要表達于傷側大腦半球損傷區及周圍水腫區域。損傷第1天，損傷組和醒腦靜組腦組織中即有Fas、Fas-L和Caspase-3明顯表達；損傷第3天，Fas 表達達高峰，其后逐漸下降；損傷第5天，Fas-L和Caspase-3表達達高峰，其后逐漸下降。損傷組各時間點和醒腦靜組第1—14天上述指標均明顯高于假手術組(P均<0.05)，醒腦靜組第3—21天Fas蛋白表達量和各時間點Fas-L、Caspase-3蛋白表達量均明顯低于損傷組(P均<0.05)。見表1～3。

圖1 損傷組損傷第5天光鏡下表現(HE，×400)

圖2 醒腦靜組損傷第5天光鏡下表現(HE，×400)

表1 3組大鼠各時間點腦組織中Fas表達情況

注：①與假手術組比較,P<0.05；②與損傷組比較,P<0.05。

表2 3組大鼠各時間點腦組織中Fas-L表達情況

注：①與假手術組比較，P<0.05；②與損傷組比較，P<0.05。

表3 3組大鼠各時間點腦組織中Caspase-3表達情況

注：①與假手術組比較，P<0.05；②與損傷組比較，P<0.05。

2.33組大鼠腦細胞凋亡情況 光鏡下觀察，凋亡主要發生在損傷區域及周圍水腫區域，細胞皺縮，細胞核為黃色顆粒狀或條塊狀，多數為神經元細胞，也有少量神經膠質細胞及血管內皮細胞。假手術組無凋亡細胞或少量細胞凋亡。損傷第7天，損傷組和醒腦靜組細胞凋亡率達高峰，此后逐漸下降。損傷組各時間點和醒腦靜組第1—14天腦細胞凋亡率均明顯高于假手術組(P均<0.05)，醒腦靜組第3—21天腦細胞凋亡率均明顯低于損傷組(P均<0.05)。見表4。

表4 3組大鼠各時間點腦細胞凋亡情況%)

注：①與假手術組比較，P<0.05；②與損傷組比較，P<0.05。

3 討 論

顱腦外傷后由于損傷造成大量炎性細胞因子、乳酸、自由基等物質堆積于傷灶局部，引起能量失調和氧化應激，進而導致細胞死亡。細胞死亡一般分為壞死和凋亡。細胞壞死是早已被認識到的一種細胞死亡方式，而細胞凋亡則是近年來逐漸被認識的一種細胞死亡方式，又稱程序性細胞死亡。已有研究證實，顱腦外傷早期腦組織細胞的壞死是由直接損傷導致的，隨后出現的繼發性腦損傷既有壞死也有凋亡的參與[3]。直接損傷導致的壞死雖然不可修復，但可以通過調控細胞凋亡而阻止繼發性腦損傷的進展。

腦外傷后，由于暴力打擊以及應激反應等因素，腦血流調節出現異常，腦組織缺氧缺血，造成細胞膜、線粒體膜等生物膜功能障礙，導致神經細胞能量代謝異常、大量自由基產生、細胞內鈣超載、脂質過氧化反應，這些因素均可啟動凋亡調控基因的表達，使細胞進入凋亡過程[4]。凋亡調控基因所表達的蛋白中就包括Caspase-3、Fas、Fas-L等調控因子。研究發現，脊椎動物細胞的凋亡主要有2種方式，一種是依賴Caspase家族的調控，另一種不依賴Caspase家族的參與[5]。根據啟動因子的不同，Caspase通路又分為2種：①Fas/Fas-L啟動的死亡受體通路，該通路通過活化Caspase-8，進一步激活其下游的效應因子Caspase-3，誘導細胞凋亡。②線粒體凋亡通路，該通路在受到凋亡信號的刺激下，線粒體內膜上細胞色素C脫落，與凋亡活化因子-1結合形成凋亡復合體活化Caspase-9, 進而激活其下游因子Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7，啟動級聯反應的凋亡程序。由此可見，Caspase-3在細胞凋亡中起關鍵作用，在整個凋亡過程中處于核心地位，是細胞凋亡的最終執行者。細胞凋亡的過程是Caspase家族參與的蛋白酶級聯反應，當Caspase-3被激活后，對不同的底物蛋白進行切割，這些蛋白降解產物不僅會引起線粒體通透性發生改變，還可導致細胞骨架蛋白斷裂、DNA修復蛋白裂解，干擾細胞DNA復制和修復，損傷細胞核的結構，從而使細胞最終出現符合凋亡改變的生化和形態學特征。

研究表明，在傳遞凋亡信號的通路中，死亡受體通路被認為是經典的傳遞通道。凋亡信號傳到細胞內部是通過死亡配體(如Fas-L、TRAIL、TNF-α、sPD-1等)與細胞膜上相應的受體(如Fas、TNF-R1、DR3、DR4、DR5和RANK等)結合，啟動凋亡程序，誘導細胞凋亡[6]。死亡受體/配體家族的共同點是在細胞內存在特異性結構域，該結構域可特異性的激活Caspase[7]。已有的實驗顯示，Fas/Fas-L是重要的啟動死亡受體通路的復合物[8]。Fas蛋白為I型跨膜蛋白，分子量為45 kDa，屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)/神經生長因子受體(NGFR)家族成員，包括3個半胱氨酸基團，半胱氨酸基團是細胞外配體的識別位點。受體Fas廣泛分布于許多正常細胞以及激活的T、B淋巴細胞上，在好多系統都可以檢測到Fas的表達。Fas-L是Fas的天然配體，分子量為40 kDa，屬于Ⅱ型膜蛋白，也是TNFR/ NGFR家族成員，Fas-L有可溶性和膜結合性2種形式，均可與Fas受體結合。Fas在細胞內有氨基酸伸展鏈稱之為死亡域(Dead Domain，簡稱DD)。當Fas-L與Fas分子結合后，導致Fas相互聚集形成三聚體復合物，進一步使細胞內的DD募集，從而形成活化的Fas相關蛋白(FADD)，FADD作為調試蛋白，在Fas及其下游分子前半胱天冬氨酸蛋白酶8 (Pro-caspase-8)之間起橋梁作用，負責激活Pro-caspase-8,活化的Caspase-8釋放到細胞質中，通過直接/間接途徑活化或裂解其下游的Caspases家族成員，如Caspase-1、Caspase- 3、Caspase- 6、Caspase- 7,激活的Caspases通過對底物蛋白的水解把凋亡信號從細胞外傳遞到細胞內，或者直接作為凋亡的效應分子降解細胞骨架、切割DNA使之成為寡聚核苷酸片段，染色質濃縮，細胞凋亡[9]。

本實驗結果顯示，損傷組傷后第1天即出現腦細胞凋亡和Fas、Fas-L、Caspase-3蛋白表達，腦細胞凋亡第7天達到高峰，Fas蛋白表達第3天達高峰，Fas-L和Caspase-3蛋白表達第5天達高峰，此后緩慢下降，上述這些變化均符合繼發性腦損傷的病理生理機制。

盡管許多重要的凋亡蛋白已被證實，但對凋亡發生的分子機制仍未完全闡明，因此也對顱腦外傷的治療提出了挑戰。醒腦靜注射液主要成分包括梔子、麝香、郁金、冰片等，其中麝香芳香開竅；冰片可以改善血腦屏障的通透性，興奮呼吸中樞，提高血氧分壓；梔子清熱開竅,具有降壓、止血、脫水作用；郁金化痰開竅，行氣解瘀通經絡。整個方劑具有清熱涼血、醒神止痙、解毒止痛、行氣活血的功效[10]?，F代藥理學研究顯示，醒腦靜注射液可通過血腦屏障直接作用于中樞神經系統，改善微循環，減輕水腫，改善腦細胞的缺氧缺血狀態，減輕細胞炎性反應，清除氧自由基，抑制細胞凋亡，對受損部位的神經細胞發揮修復和保護作用[11]。楊超等[12]在常規西藥治療基礎上加用醒腦靜注射液治療急性腦外傷合并意識障礙患者40例，結果治療后GCS評分及NIHSS評分明顯好轉，預后良好。張紅等[13]用自由落體方法制造腦外傷大鼠模型觀察凋亡調節蛋白c-fos的表達情況，發現外傷組及醒腦靜組造模24 h后均檢測到c-fos蛋白的高表達,但是醒腦靜組c-fos蛋白表達量明顯低于外傷組，證實醒腦靜注射液可抑制損傷細胞的凋亡。本實驗結果顯示，醒腦靜組各時間點Fas-L、Caspase-3蛋白表達量和第3—21天Fas蛋白表達量和細胞凋亡率均明顯低于損傷組，進一步證實了醒腦靜注射液可通過抑制凋亡調節蛋白從而起到抑制凋亡的作用。

綜上所述，Fas、Fas-L和Caspase-3蛋白參與了顱腦外傷大鼠腦細胞損傷過程；醒腦靜注射液干預可明顯減少顱腦外傷大鼠腦細胞的凋亡，降低Fas、Fas-L和Caspase-3蛋白的表達，其可能是通過影響信號轉導的死亡受體通路發揮作用的，但其涉及哪些分子調控及信號轉導的具體路徑還有待進一步研究探討。

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