溶血卵磷脂在內皮細胞泡沫化模型中的作用探討

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病已經成為當今社會影響人類健康的重要疾病,目前病因尚未完全明確,一般認為動脈粥樣硬化是多病因疾病,是多因素共同作用的結果。近年來多數學者支持“內皮損傷反應學說”,認為本病的各種主要危險因素最終都損傷動脈內膜,其中高血脂損傷內皮細胞導致脂肪沉積出現不同程度的內皮細胞泡沫化,被認為是動脈粥樣硬化的最重要的危險因素[1-2],血管內皮的損害是動脈粥樣硬化的始動因素[3-4]。氧化型低密度脂蛋白 (ox-LDL) 是主要的致動脈粥樣硬化因素[5-6],ox-LDL 的主要活性成分是溶血卵磷脂(lysophosphatidylcholine,lpc),lpc 能模擬 ox-LDL 致動脈粥樣硬化作用[7-9]。目前很多文獻報道用lpc干預人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)制作內皮脂質化損傷的泡沫化細胞模型。如何制作理想的內皮脂質化損傷的泡沫化細胞模型,是進一步實驗研究的基礎。目前在很多文獻里一般都僅僅關注了lpc的終濃度,也就是lpc的絕對濃度對細胞模型成敗的影響,但是筆者在多次制作內皮脂質化損傷的泡沫化細胞模型實踐中發現, lpc的相對濃度對內皮脂質化損傷的泡沫化細胞模型的成敗也很重要,lpc的相對濃度主要通過細胞不同的接種密度和lpc不同的干預終體積來體現。希望本文總結的實驗經驗能夠給制作內皮脂質化損傷的泡沫化細胞模型的初學者一些借鑒。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 CKX41顯微鏡:Olympus公司; CO2細胞培養箱:Thermo公司;生物安全柜:BAKER公司;ECM培養基: Sciencell公司;溶血卵磷脂(lpc):Sigma公司; DMEM basic:Gibco公司;紅油O試劑盒:ScienCell公司。

1.2 實驗細胞 HUVECs購于美國ATCC。

1.3 實驗方法

1.3.1 lpc配制:稱取lpc 2.5 mg放于滅菌EP管中,用無血清DMEM 25 ml,配制成濃度為100 mg/L的lpc母液,以0.22 μm混合纖維素微孔濾膜正壓過濾除菌,分裝后-20 ℃保存備用。

1.3.2 細胞活力檢測:采用細胞增殖和毒性檢測試劑盒(CCK-8)進行檢測,上述細胞活力檢測實驗按照試劑盒使用說明進行操作,加入CCK-8后1 h,酶標儀讀取各組OD值反映所在組的細胞活力。細胞存活率(%)=(實驗孔OD值-空白孔OD值)/(對照孔OD值-空白孔OD值)×100 %。

1.3.3 HUVECs的不同接種密度對lpc干預后細胞存活率的影響:實驗分6組,每組分別設對照組和實驗組,每組3個復孔, HUVECs接種于96孔板,HUVECs的不同接種密度分別為A組 0.5×104/孔、B組 0.75×104/孔、C組 1.0×104/孔、D組 1.25×104/孔、E組 1.5×104/孔、F組 2×104/孔,每孔加入終體積100 μl ECM完全培養基培養12 h后換液,對照組加入無lpc無血清DMEM,終體積100 μl,實驗組參照文獻[8-9]常用的方法,用終濃度含10 μg/ml lpc的無血清DMEM,終體積100 μl;培養24 h檢測細胞活力。

1.3.4 不同濃度的lpc對HUVECs細胞存活率的影響:實驗分5組,每組3個復孔。A組:對照組,無lpc;B組:lpc 5 μg/ml;C組:lpc 10 μg/ml;D組:lpc 20 μg/ml;E組: lpc 40 μg/ml。HUVECs接種于96孔板,細胞密度1.0×104/孔,每孔加入終體積100 μl ECM完全培養基培養12 h后換液,A組加入終體積為100 μl無lpc無血清DMEM;B、C、D、E組加入lpc的終濃度分別為5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml的無血清DMEM 100 μl繼續培養24 h測細胞活力。

1.3.5 lpc的不同干預體積對HUVECs細胞存活率的影響:實驗分6組,每組分別設對照組和實驗組,每組3個復孔, HUVECs接種于96孔板,對照組與實驗組的HUVECs的密度均為1.0×104/孔,每孔加入終體積100 μl ECM完全培養基培養12 h后換液,根據實驗設計換液后各組加入培養液的終體積分別為A組 50 μl,B組75 μl, C組100 μl,D組125 μl,E組150 μl,F組200 μl,每個對照組為無lpc無血清DMEM,每個實驗組為含終濃度10 μg/ml lpc同體積的無血清DMEM,培養24 h檢測細胞活力。

1.3.6 初次與再次脂質化損傷的HUVECs存活率變化實驗:實驗分2組,每組分別設對照組與實驗組,各組3個復孔。A組 初次脂質化組: 對照組,HUVECs接種于96孔板,加終體積100 μl ECM完全培養基培養12 h,換無血清DMEM終體積100 μl繼續培養24 h,用于檢測;實驗組,HUVECs接種于96孔板,加終體積100 μl ECM完全培養基培養12 h,換終濃度10 μg/ml lpc的無血清DMEM終體積100 μl繼續培養24 h,用于檢測。B組 再次脂質化組: 對照組,取初次脂質化經過lpc干預24 h后的HUVECs,再次胰酶消化傳代接種于96孔板,后續培養及干預條件與A組對照組相同;實驗組,取初次脂質化經過lpc干預24 h后的HUVECs,再次胰酶消化后接種于96孔板,后續培養及干預條件與A組實驗組相同。

1.3.7 lpc干預后內皮細胞泡沫化檢測:HUVECs接種于96孔板,HUVECs接種密度為1.0×104/孔,培養液終體積100 μl/孔,實驗分2組,每組3個復孔:A組,無lpc對照組,加入終體積100 μl ECM完全培養基培養12 h后換液,加入終體積為100 μl無lpc無血清DMEM繼續培養24 h,用油紅O試劑盒檢測內皮細胞泡沫化。 B組,lpc干預組,HUVECs接種于96孔板,加入終體積100 μl ECM完全培養基培養12 h后換液,加入lpc終濃度為10 μg/ml終體積100 μl的無血清DMEM繼續培養24 h,用油紅O試劑盒檢測內皮細胞泡沫化。內皮細胞泡沫化檢測按照油紅O試劑盒檢測說明書進行操作。

2 結果

2.1 HUVECs的不同接種密度對lpc干預后細胞存活率的影響 結果顯示隨著內皮細胞接種密度的增加,lpc干預后細胞存活率隨之增加,細胞接種密度在(0.5～1.5)×104/孔各組間細胞存活率差異均有統計學意義,2×104/孔組的細胞存活率比1.5×104/孔組稍有增高,2組間差異無統計學意義。各組細胞存活率結果見圖1。

注:統計學結果均是每一組細胞存活率與相鄰的前一組相比較;ns:P>0.05;*P<0.05;** P<0.01;***P<0.001圖1 HUVECs的不同接種密度對lpc干預后細胞存活率的影響

2.2 不同濃度的lpc對HUVECs細胞存活率的影響 結果顯示，lpc干預組各組間隨著lpc濃度的增加，細胞存活率出現下降趨勢，5 μg/ml組細胞存活率高達(89.96±3.06)%，40 μg/ml組細胞存活稀少，存活率僅有(5.18±0.88)% ，各組細胞存活率結果見圖2。

注:統計學結果均是每一組細胞存活率與相鄰的前一組相比較;*P<0.05;** P<0.01;***P<0.001圖2 不同濃度的lpc對HUVECs存活率的影響

2.3 lpc的不同干預體積對HUVECs細胞存活率影響的結果 在同樣的細胞接種密度,同樣的lpc濃度干預條件下,lpc不同的干預體積也是對細胞存活率顯示出了明顯的影響,從50 μl/孔到150 μl/孔各組細胞存活率隨著lpc干預體積的增加細胞存活率逐漸降低,并且每組間都有統計學差異,200 μl/孔組的細胞存活率比150 μl/孔組的細胞存活率進一步降低,但是差異無統計學意義,各組細胞存活率結果見圖3。

注:統計學結果均是每一組細胞存活率與相鄰的前一組相比較;ns:P>0.05;*P<0.05;** P<0.01;***P<0.001圖3 lpc的不同干預體積對HUVECs細胞存活率的影響

2.4 初次與再次脂質化損傷的HUVECs存活率實驗結果 再次脂質化損傷的內皮細胞存活率比較特殊,不是因為再次受到lpc損傷而進一步下降,反而較初次脂質化損傷的細胞存活率出現了明顯的升高,而且差異有統計學意義,各組細胞存活率結果見圖4。

注:2組間比較,***P<0.001圖4 初次與再次脂質化損傷的HUVECs存活率

2.5 lpc干預后內皮細胞泡沫化檢測結果 結果顯示無lpc干預的對照組HUVECs內未見油紅O染色(見圖5,6),lpc干預的實驗組HUVECs內出現較多的油紅O染色(見圖7,8),提示HUVECs出現了泡沫化。

圖5 對照組內皮細胞內未見油紅O染色(顯微鏡啟用顏色視野,×200)

圖6 對照組內皮細胞內未見油紅O染色 (顯微鏡啟用白平衡視野,×200)

圖7 lpc組內皮細胞內見油紅O染色(顯微鏡啟用顏色視野,×200)

圖8 lpc組內皮細胞內見油紅O染色 (顯微鏡啟用白平衡視野,×200)

3 討論

本實驗顯示無lpc干預的對照組HUVECs內未見油紅O染色,給予lpc干預的實驗組HUVECs內出現較多的油紅O染色,顯示HUVECs出現了泡沫化,表明本實驗成功制作了lpc脂質化損傷內皮的泡沫化細胞模型。有文獻報道用油紅O染色觀察組織或細胞的脂質化程度[10-11],油紅O染色量的多少可以反映HUVECs內的脂肪滴多少,是直觀體現HUVECs泡沫化程度的一個指標。

本實驗顯示lpc 5 μg/ml時細胞存活率與對照組相比降低較少,lpc的濃度從10～40 μg/ml,各組細胞存活率明顯下降,各組間有統計學差異。本實驗顯示lpc的濃度達20 μg/ml及40 μg/ml時細胞存活率僅為(13.31±4.46)%和(5.18±0.88)%,鏡下觀察存活細胞不僅數量稀少而且生長狀態不好,難以用于有效實驗研究,本實驗結果與文獻報道一致[12]。用lpc作用于HUVECs制作脂質化損傷內皮的泡沫化細胞模型時,一般都認為lpc的終濃度為10 μg/ml時是制作內皮脂質化損傷泡沫化細胞模型的適宜濃度,但是實踐中發現在終濃度10 μg/ml的lpc干預條件下,不同的細胞接種密度和不同的lpc干預體積導致的細胞存活率差別很大,可能出現lpc干預組細胞存活率過低或者無lpc干預的對照組細胞增長過度密集，出現生長抑制的現象。

目前文獻報道在進行lpc干預HUVECs的脂質化損傷實驗時,96孔板上HUVECs接種密度為(0.1～2)×104/孔不等[13-14],各文獻報道細胞接種密度差異巨大,但是細胞接種密度對細胞存活率的影響未見報道。本實驗顯示HUVECs不同接種密度對細胞存活率的影響也很大,在0.5×104/孔時細胞增殖速度緩慢,lpc干預后細胞存活數量稀少。接種數量為(0.75～1.5)×104/孔時細胞增長速度有明顯增加,而且lpc干預后細胞存活率從(35.41±4.00)%逐漸增加到(76.80±5.83)%,而且各組間有統計學差異。但是2×104/孔組lpc干預后細胞存活率增高速度放緩,與1.5×104/孔組細胞存活率差異無統計學意義,而且此時對照組細胞出現增長過度密集,可能引發細胞生長抑制。這說明內皮細胞脂質化損傷的細胞模型成敗不僅與合適的lpc干預濃度有關,也與適宜的HUVECs接種密度有關。細胞接種密度過于低時,細胞增長緩慢而且lpc干預后細胞稀少可能無法獲得有效的細胞數量進行有效的實驗研究。增加細胞接種密度可以增加細胞增長速度并且提高lpc干預后的細胞存活率。但是細胞接種密度增加到一定程度可能給對照組細胞帶來過度增長，出現生長抑制現象從而影響實驗結果的準確性,這一點需要避免出現。

本實驗還發現lpc干預后細胞存活率與培養孔內的lpc干預體積有關,也就是與lpc干預時的培養液的終體積有關,實驗結果顯示在同樣的細胞接種密度和同樣的lpc終濃度條件下,lpc干預的實驗組細胞存活率與lpc干預體積呈負相關。實驗結果表明，在lpc干預HUVECs的脂質化損傷的細胞模型中,在不增加細胞接種密度的條件下,通過調節lpc干預體積,細胞存活率的變化范圍很大,可以從(17.19±1.82)%調節到(77.78±4.10)%,從而滿足不同的實驗目的和不同的實驗需求,同時也避免了單純依靠增加細胞接種密度提高細胞存活率時導致的對照組細胞出現過度生長抑制的現象,因此lpc干預體積也可以作為調節細胞存活率的又一個有效參數。因此通過綜合調節lpc濃度、細胞接種密度以及lpc干預體積可以更加有助于制作一個滿足不同實驗需求的脂質化損傷的泡沫化細胞模型。

本實驗還發現再次脂質化損傷的內皮細胞存活率較初次脂質化損傷的細胞存活率明顯升高,而且差異有統計學意義,出現這種現象是否是因為在脂質化損傷的過程中內皮細胞對脂質損傷出現了預適應還是其他的分子機制,在今后的實驗研究中將會進一步探索。

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