鎮喘保肺湯對支氣管哮喘腎氣虛證模型大鼠尿液代謝組學研究

鄭建平 宋紅

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是全球最常見的慢性疾病之一，資料顯示全世界約有3億哮喘患者，且近年來有上升趨勢［1-2］。王大偉等［3］認為腎虛貫穿于哮喘發病的全過程。目前西藥如吸入糖皮質激素雖能治療哮喘，但長期使用會導致反射性咳嗽、支氣管痙攣、骨質疏松、感染、生長受限等副作用［4］。而中醫藥以整體觀念為指導，充分應用中藥多靶點解毒抗炎、增效減毒等優勢，還能改善患者過敏體質、增強免疫力，臨床療效好，且不易復發［5-6］。鎮喘保肺湯由人參、三七、附子、五加皮、何首烏、沉香、蛤蚧組成，臨床治療急性發作的虛證哮喘，具有良好的療效。2015年5月至2016年3月作者通過實驗研究，探討鎮喘保肺湯治療腎氣虛哮喘的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠36只，體重200～250g，SPF級，雄性，由浙江中醫藥大學動物實驗研究中心提供。

1.2 主要儀器與試劑 OVA卵清蛋白（sigma公司），氫氧化鋁凝膠（上海美興化工股份有限公司），0.9%氯化鈉注射液（科倫制藥有限公司），梅花針（固始公元醫療器械有限公司），5417R型冷凍臺式高速離心機（德國Eppendorf公司），超聲霧化吸入器（江蘇魚躍醫療設備股份有限公司），超高效液相質譜聯用儀（德國安捷倫公司）。

1.3 藥物 鎮喘保肺湯由人參15g、三七12g、附子15g、五加皮 15g、何首烏 10g、沉香 1g（研末）、蛤蚧 1.5g（研末）組成。購自浙江中醫藥大學中醫門診部，經中藥制劑室鑒定。

1.4 方法 （1）動物與分組：清潔級雄性Wistar大鼠36只，體重200～250g，隨機分為正常對照組，腎氣虛哮喘模型組以及中藥組，每組12只。（2）動物模型制備：腎氣虛哮喘模型組和中藥組于實驗的第1、8、15天共3次在腹腔分2點注射10%卵白蛋白生理鹽水溶液1ml致敏；第3次致敏1周后，模型組和中藥組動物每日超聲霧化吸入1%卵白蛋白生理鹽水溶液20min，誘發其哮喘發作，直至霧化時出現大鼠發生打噴嚏、咳嗽、呼吸困難和喘息、大小便失禁、抓耳朵、發紺等癥狀說明大鼠模型制備成功，連續激發21 d。正常對照組予生理鹽水代替抗原進行致敏和激發。（3）給藥處理及樣本采集：中藥組大鼠于實驗第15天（即激發第一天）開始給予鎮喘保肺湯2.0 g/kg（灌胃），正常對照組、腎氣虛哮喘哮模型組給生理鹽水灌胃。各組大鼠分別干預15d（實驗第30天）處理，稱體重，取晨尿，置于-80℃環境中冷凍備用。（4）液質聯用尿液樣本制備：將儲存在-80℃環境下的尿液取出并自然解凍，然后將200μl尿液與600μl水液混合在EP管內，放置于渦輪儀以4℃，12000r/min，離心10min，等待液質聯用分析。（5）液質聯用技術分析：液質聯用技術可以充分采集到大鼠尿液中的中藥化學成分并加以分析，同時還可以得到中藥化學成分的保留時間、紫外光譜、分子量及特征結構碎片等豐富信息。將最終結果組織為二維數據矩陣，包括變量（rt_mz，即保留時間_質荷比）、分子量（mass）觀察量（樣本）和峰強。將編輯后的數據矩陣導入SIMCA-P軟件（版本13.0）進行主成分分析（PCA）及偏最小二乘方判別分析（PLS-DA）。進一步采用有監督式方法OPLSDA進行建模分析此模型可靠程度。

2 結果

2.1 一般情況 實驗處理過程中大鼠有部分死亡，最終正常組8只，反應靈活，毛發光澤，進食及二便正常。腎氣虛哮喘組9只，活動明顯減少，毛發枯燥，反應遲緩，納少，體重增幅減輕，懸尾及游泳時間縮短等腎氣虛表現。中藥組10只，狀態較腎氣虛哮喘組均有明顯好轉。

圖2 Z-M兩組的PCA得分圖（pos）

2.2 PCA分析 K組、Z組與M組的聚類現象比較明顯，表明各組間尿液代謝物存在顯著差異。見圖1、2。2.3 PLS-DA分析 圖3、圖4的R2Y和Q2均＞0.4，且從排序驗證圖看模型不存在“過擬合”現象。因此認為該模型可靠，并且組間存在顯著差異。

圖3 M-K兩組的PLS-DA得分圖（pos）及排序驗證圖

圖4 Z-M兩組的PLS-DA得分圖（pos）及排序驗證圖

2.4 OPLS-DA分析 采用有監督式方法OPLS-DA進行建模分析，R2Y和Q2仍＞0.4，進一步表明該模型可靠。見圖5、6。

圖5 M-K兩組的OPLS-DA得分圖（pos）

圖6 Z-M兩組的OPLS-DA得分圖（pos）

2.5 差異代謝物的鑒定 見表1、2。

表1 正模式下Z-M兩組的差異性代謝物

表2 正模式下M-K兩組差異性代謝物

3 討論

鎮喘保肺湯是由人參、三七、附子、五加皮、何首烏、沉香、蛤蚧組成。現代藥理學研究表明，其具有良好的抗炎、增強免疫功能的作用。另外，人參、三七、附子、五加皮、蛤蚧還能夠刺激垂體-腎上腺皮質系統，提高機體應激狀態，同時興奮垂體性腺，對機體呈現雌激素和雄激素樣作用。

代謝組學是研究生物體內源代謝物的種類、數量及其在內外因素下變化規律的組學技術［7］，是以組群指標為分析基礎，通過高通量檢測和數據處理，同時對特定時期內所有的內源性低分子物質進行定性和定量分析，這與中醫學整體觀念和辨證論治的理論內涵相一致［8-9］。色譜和質譜聯用技術，特別是高分辨質譜憑借其普適性、高靈敏度和特異性的特點，逐漸成為代謝組學研究的主流技術［10］。液質聯用技術已經成為中藥各類成分分析的重要手段，其所提供的大量結構信息不僅對中藥成分的分析鑒定提供依據，也為中藥或中藥復方的體內過程研究和代謝產物的分析奠定基礎，對中藥物質基礎和作用機制的研究發揮著重要作用［11］。

腎上腺糖皮質激素主要作用是調節糖、蛋白及脂肪的代謝，生理劑量的糖皮質激素是維持人體正常機能活動所必需的，而超過生理劑量的激素則突出的表現為抗炎、抗毒、抗過敏的藥理作用［12］。相對于正常組，腎氣虛哮喘模型組的皮質酮、尿可的松、脫氧皮質酮明顯下降，表明哮喘組大鼠腎上腺皮質功能減退，下丘腦一垂體一靶腺軸功能被破壞［13］，進而導致脂類代謝失常，大鼠出現行動遲緩、蜷縮倦怠、毛發枯燥等腎氣虛的證候。大量臨床及動物研究表明，哮喘反復難愈的原因之一就在于其本身存在下丘腦-垂體-靶腺軸不同程度的抑制現象，同時出現內源性糖皮質激素受體缺陷，而糖皮質激素只有和受體結合后才能發揮作用［14］。相對于哮喘組，中藥組大鼠在服用鎮喘保肺湯治療后，皮質酮、尿可的松、脫氧皮質酮明顯上升，腎氣虛癥狀及哮喘明顯好轉，表明鎮喘保肺湯對治療腎氣虛哮喘有一定治療作用。其作用機制可能是通過興奮下丘腦-垂體-靶腺軸，且提升內源性糖皮質激素受體含量，增加糖皮質激素與受體結合實現的［15］。同時中藥組大鼠出現21-羥基孕烯醇酮、2-羥基雌二醇、雌激素酮等雌激素的升高。有研究表明，雌激素可提高血中載脂蛋白A1的含量，降低血清總膽固醇濃度，使β-脂蛋白減少、膽固醇和磷脂比例下降，有助于改善脂類代謝紊亂［16］。β-谷甾醇作為一種植物甾醇具有明顯降低血清膽固醇的功效。中藥組β-谷甾醇含量升高，提示鎮喘保肺湯可能正在改善脂類代謝。相對于正常組，模型組大鼠二十四碳六烯酸、硬脂酸的含量升高，提示體內脂肪酸代謝紊亂，免疫力下降，肝腎受損。在服用鎮喘保肺湯后，大鼠二十碳五烯酸、二十二烷酸等脂肪酸開始下降，表明鎮喘保肺湯能夠改善脂肪酸代謝，增強肝腎功能，提高機體免疫能力。

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