大黃素對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎小鼠的免疫保護(hù)作用研究

夏亞男 李寧? 葉志鵬 黃捷 徐濤 吳可人

慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎（CLT）又稱自身免疫性甲狀腺炎、橋本氏病，是一種以自身甲狀腺組織為靶器官損害的慢性炎癥性自身免疫性疾病，約占甲狀腺疾病的22.5%，其發(fā)病機(jī)制至今尚未清楚，目前認(rèn)為是遺傳和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果［1］。近年來(lái)發(fā)病率有明顯上升趨勢(shì)，全世界發(fā)病率約0.15%～0.3%［2］。CLT治療主要是糾正甲狀腺功能異常和甲狀腺腫大對(duì)癥處理［3］。目前常用的藥物治療如甲狀腺激素替代治療、局部免疫調(diào)節(jié)治療、硒治療及中醫(yī)藥治療等，均取得一定的臨床療效。大黃素屬蒽醌類衍生物，是中藥大黃的重要單體，有一定的免疫抑制作用。2016年6月至2017年6月作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，探討大黃素對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎小鼠的免疫保護(hù)作用與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 6～8周齡NOD小鼠30只，雌雄不限，隨機(jī)分為3 組，分別為對(duì)照組、模型組和大黃素組，每組各10只。

1.2 試劑與儀器 CD4、CD8、IFN-γ、IL-4抗體試劑盒；小鼠TgAb酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒；ELISA檢測(cè)儀；流式細(xì)胞儀等。

1.3 動(dòng)物模型建立 造模組小鼠飲用0.05%碘水（0.64g/L NaI）持續(xù) 8周，對(duì)照組小鼠飲用去離子水。造模4周后對(duì)大黃素組小鼠按大黃素75mg/（kg·d）灌胃處理，對(duì)照組和模型組小鼠分別以等量生理鹽水灌胃，4周后處死小鼠，取外周血及甲狀腺。

1.4 標(biāo)本采集 小鼠乙醚麻醉后，取眶靜脈血，室溫靜置6h，3000r/min離心20min，分離血清。于小鼠頸部正中切開(kāi)并顯露出兩葉甲狀腺組織，取下氣管和甲狀腺并迅速剝離甲狀腺，冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干。

1.5 甲狀腺病理學(xué)檢查 小鼠甲狀腺組織4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切成4μm切片，蘇木素-伊紅（HE）染色。采用圖像分析計(jì)算炎癥細(xì)胞（子目標(biāo)面積）與甲狀腺組織（目標(biāo)面積）的比值，參考Tang H等［4］的炎癥分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：正常甲狀腺組織；1級(jí)：淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度＜1%；2級(jí)：淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度占1%～10%；3級(jí)：淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度占11%～40%；4級(jí)：淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度＞40%。

1.6 血漿TgAb水平測(cè)定 采用 ELISA試劑盒雙抗體夾心法測(cè)定：在各孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品各100μl，37℃孵育90min；加入100μl生物化抗體工作液，37℃孵育60min；洗滌3次；加入100μl酶結(jié)合物工作液，37℃孵育30min；洗滌5次；加入90μl底物溶液，37℃孵育15min左右；加入50μl終止液，立即在450nm波長(zhǎng)測(cè)量OD值并計(jì)算結(jié)果。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）測(cè)定外周血單核細(xì)胞（PBMC）中T細(xì)胞亞群頻率 取三組小鼠外周血，分離PBMC細(xì)胞懸液。采用FCM檢測(cè)分析三組小鼠PBMC中CD3+CD4+、CD3+CD8+T細(xì)胞的頻率差異。使用50ng/ml佛波酯和1μg/ml離子霉素刺激兩種細(xì)胞6h后，再應(yīng)用FCM術(shù)檢測(cè)分析三組小鼠PBMC中CD3+CD4+IFN-γ+、CD3+CD4+IL-4+T細(xì)胞頻率差異。1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

模型組小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡1只，其余各組小鼠均存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

2.1 甲狀腺病理學(xué)檢測(cè)及分級(jí) 顯微鏡下可見(jiàn)對(duì)照組甲狀腺濾泡大小較為均勻一致，濾泡上皮細(xì)胞為單層立方形或高柱形。模型組濾泡結(jié)構(gòu)紊亂，上皮細(xì)胞擠壓變扁，間質(zhì)減少，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。大黃素組濾泡結(jié)構(gòu)尚可，大小不一，少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（見(jiàn)圖1）。根據(jù)炎癥分級(jí)，大黃素組、模型組炎癥程度均高于對(duì)照組，且大黃素組低于模型組，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）見(jiàn)表1。

圖1 各組小鼠甲狀腺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況（HE染色 10×10

表1 甲狀腺病理分級(jí)比較

2.2 血漿抗小鼠甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）水平檢測(cè) 8周后檢測(cè)各組小鼠血漿中TgAb濃度，大黃素組TgAb濃度低于模型組而高于對(duì)照組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。模型組TgAb濃度較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 TgAb各組間比較［ng/L，（x±s）］

2.3 外周血單核細(xì)胞CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞的頻率差異 造模后各組小鼠PBMC中CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞相對(duì)頻率均比對(duì)照組明顯增加，且大黃素組增加幅度低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。相比對(duì)照組，造模后各組小鼠PBMC中CD3+CD4+INF-γ+T細(xì) 胞、CD3+CD4+IL-4+T細(xì)胞相對(duì)頻率均增加，且大黃素組增加幅度低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖2 各組PBMC中CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞的差異比較

3 討論

慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎是臨床最常見(jiàn)的自身免疫性甲狀腺病，以甲狀腺內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和TgAb等自身抗體的生成為主要特征，受遺傳和環(huán)境等多種因素影響，其確切發(fā)病機(jī)制尚不明確［5］。本研究通過(guò)過(guò)量的碘劑誘導(dǎo)NOD小鼠建立EAT動(dòng)物模型，造模小鼠甲狀腺病理觀察顯示甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)紊亂，上皮細(xì)胞擠壓變形，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，同時(shí)血漿TgAb水平明顯升高，表明過(guò)量碘劑誘導(dǎo)NOD小鼠建立EAT動(dòng)物模型成功［6］。

CD4+和CD8+T細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)中的兩種重要免疫細(xì)胞，CD4 主要表達(dá)于輔助T（Th）細(xì)胞，是Th細(xì)胞TCR識(shí)別抗原的共受體，與MHCⅡ類分子的非多肽區(qū)結(jié)合，參與Th細(xì)胞TCR識(shí)別抗原的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。而CD8主要表達(dá)于細(xì)胞毒性T細(xì)胞上，通過(guò)表面的MHCⅠ分子與CD4等其他免疫細(xì)胞的MHCⅡ分子結(jié)合，從而識(shí)別其他免疫細(xì)胞表面結(jié)合的抗原物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，大黃素通過(guò)調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群之間的平衡、分化及其分泌能力而發(fā)揮免疫保護(hù)作用。郭向華等［7］研究發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素能夠調(diào)節(jié)CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞亞群間的平衡，抑制Th1 型/Tc1 型細(xì)胞分化而發(fā)揮免疫抑制作用。沈乃營(yíng)等［8］認(rèn)為大黃素在體外可以通過(guò)調(diào)節(jié)活化淋巴細(xì)胞IL-4分泌的影響而發(fā)揮免疫抑制作用。本研究中，造模小鼠PBMC中CD4+和CD8+T細(xì)胞相對(duì)頻率和血漿TgAb水平均較對(duì)照組增加，且大黃素組增加幅度明顯低于模型組，大黃素的攝入減輕模型動(dòng)物甲狀腺組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度，并降低血漿TgAb升高幅度，表明大黃素對(duì)EAT動(dòng)物模型甲狀腺組織有一定的免疫保護(hù)作用。

未致敏（naive）CD4+T細(xì)胞經(jīng)抗原刺激后分化為T(mén)h0細(xì)胞，然后在不同細(xì)胞因子等誘導(dǎo)下功能性分化為T(mén)h1或Th2細(xì)胞而發(fā)揮作用。IFN-γ主要由Th1細(xì)胞分泌，能通過(guò)直接調(diào)節(jié)靶細(xì)胞對(duì)凋亡的易感性，參與細(xì)胞凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)，促使甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，導(dǎo)致甲狀腺組織破壞［9］。IL-4主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，其可誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞增殖、分化，促使其產(chǎn)生與體液免疫相關(guān)的特異性抗體，并使Th1 /Th2細(xì)胞因子的平衡改變，抑制Th1細(xì)胞因子介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)。機(jī)體正常時(shí)，Th1和Th2細(xì)胞功能處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，維持機(jī)體正常的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激時(shí)，可導(dǎo)致Th1、Th2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子失衡，該現(xiàn)象又稱Th1/Th2漂移。目前多數(shù)學(xué)者研究認(rèn)為，Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡偏移可以導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)免疫功能紊亂，可能是自身免疫性甲狀腺疾病發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制［10-12］。本研究中，造模后小鼠PBMC細(xì)胞中CD3+CD4+INF-γ+ T細(xì)胞和CD3+CD4+IL-4+T細(xì)胞頻率相比對(duì)照組均明顯增加；大黃素干預(yù)的造模小鼠，Th1和Th2細(xì)胞因子陽(yáng)性的T細(xì)胞頻率均低于模型組，表明大黃素抑制Th細(xì)胞增殖分化及其細(xì)胞因子的分泌，減弱造模小鼠甲狀腺組織的炎癥反應(yīng)。

綜上，造模后小鼠PBMC中CD4+和CD8+T細(xì)胞、Th1和Th2細(xì)胞頻率相比對(duì)照組均明顯增加，且大黃素組各細(xì)胞頻率低于模型組，表明大黃素通過(guò)抑制CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞增殖分化，抑制Th1細(xì)胞因子IFN-γ和Th2細(xì)胞因子IL-4的分泌，從而減輕造模小鼠甲狀腺組織的炎癥反應(yīng)。

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