3種奶牛乳腺炎常見致病菌多重PCR檢測方法的建立

（江蘇省張家港市金港鎮動物防疫站，江蘇張家港 215600）

對于奶業的發展來說，乳腺炎可以說是危害極為嚴重的，而且是在全球范圍廣泛存在的，很容易導致嚴重的經濟損失。究其原因的話，主要就是由于病原菌導致乳腺組織遭受感染，進而出現一定程度的損傷，最終對奶的產量和品質產生不良的影響，有時候也會導致一些臨床癥狀的出現。

1 奶牛乳腺炎常見致病菌多重PCR檢測方法的研究與分析

對于臨床標本病原菌的檢驗方式，目前所采用的檢驗方法依然是培養法，也就是說等到標本的采集完成了以后，先通過增菌培養液達到增菌的目的，等到有陽性結果呈現的時候，再進行單個菌落的分離，結合形態學、生理學、免疫學等進行確診。這種方法準確度比較高，但是時間消耗是比較長的，所以從臨床的需求來看，是無法很好滿足實際要求的。還有一個問題就是，病原菌在剛剛侵襲的時候，細菌的數量是比較少的，或者說只有當乳中有大量淋巴細胞或者體細胞出現的時候，能夠引起臨床感染癥狀，這樣的話，傳統細菌學培養可能呈現陰性。PCR方法的出現可以說是恰好能夠彌補細菌學培養的不足，也逐漸成為乳腺炎病原菌鑒定的一種有效方法。這種檢測方法最為典型的特點是樣品劑量少，檢測時間比較短，這也是能夠在臨床上廣泛應用與推廣的重要原因。

2 關于奶牛乳腺炎常見致病菌多重PCR檢測方法建立的研究與分析

2.1 研究的材料與方法

在實驗中會用到菌株、培養基以及相關的試劑，其中各類對照菌種是由某大學微生物實驗室所提供的，所用到的試劑盒主要就是DNA回收試劑盒以及質粒DNA提取試劑盒，是由上海某公司所提供的；另外，還需要用到PCR試劑盒，實驗中的增強劑是從北京某公司所購買的，載體等均是從某生物工程公司購買的。

在實驗的過程中，需要做好三種主要致病病原菌種的分離與鑒定，步驟基本是相同的，首先需要做好的培養基的分離工作，然后進行生化性鑒定，最終完成分離與鑒定，確定是否就是這種菌種。

2.2 樣本的采集

樣品主要是源于當地的六個奶牛養殖場，進行了臨床乳腺炎奶樣的采集，樣本的總數量是34份。乳腺炎一旦有了臨床的癥狀表現，往往就是擠奶的工作人員在工作過程中所發現的，在進行樣本的采集之前，需要首先做好清潔工作，采樣后立即送實驗室檢查，注意時間的間隔不能夠超過24h。

2.3 引物的設計

引物設計的主要原理就是金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌的序列位于16SrRNA和23sRNA之間，同時進行了片段的擴增，針對兩對引物，片段分別擴增了420bp和270bp，而酵母菌的片段擴增長度則是730bp左右。

首先，關于金黃色葡萄球菌

其次，關于無乳鏈球菌

第三，關于酵母真菌

2.4 PCR的特異性檢測

關于PCR的特異性檢測，主要就是通過對實驗設計的3對引物，對于不同類型的細菌分別進行PCR的擴增，除了無乳鏈球菌、酵母菌以及金黃色葡萄球菌有擴增出目的條帶，其余都沒有，這樣的話，就可以表明這種方法的特異性表現是比較理想的。

圖 不同種類對照細菌的PCR擴增

2.5 多重PCR牛乳腺炎檢測方法的建立

由于受到退火溫度、退火的具體時間以及反應條件等多重因素的影響，最終對于多重PCR反應而言，最佳的反應條件應該是這樣的：首先預變性應該是在94℃條件下發生的，時間應該是三分鐘，然后變性同樣是在94℃的條件下進行的，只是時間僅僅是1min，然后等到溫度降低到57.5℃的時候，開始退火，時間是40s，在溫度是72℃的條件下進行延伸，時間是40s，這樣的循環在進行36次之后，在72℃的溫度條件下進行反應，時間是10min。

2.6 多重PCR的敏感性檢測

從多重PCR的敏感性檢測結果來看，在經過了生理鹽水稀釋處理之后，無論是對于金黃色葡萄球菌，抑或是無乳鏈球菌，以及酵母真菌來說，多重PCR的最小檢測濃度都是相同的，但是對于牛奶中不同菌種檢測的最小濃度是有所差異的。

圖PCR的擴增分析

2.7 多重PCR對乳腺炎臨床樣品的檢測

通過已經建立的多重PCR檢測體系，對于34份樣本進行了檢測，從檢測的結果來看，這種檢測方法是高效快速的，是能夠有效檢測出致病菌種的。

3 討論

文章主要就是通過試驗建立了多重PCR的方法，主要目的就在于希望能夠對于導致奶牛感染乳腺炎的三種致病病菌進行檢測，分別是金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌以及酵母菌，在實驗的具體過程中，對于PCR模板的制備主要是運用了兩種方法，在運用CTAB方法對其進行抽提的時候，如果是從奶樣中進行抽提的話，為了保證預期的良好效果，需要首先對樣品進行洗滌，而且洗滌最好要充分一些，主要目的是為了將鈣離子去除，盡量避免其可能導致的影響。

相對于常規的方法來說，多重PCR是同時涉及多個模塊和多對引物的，這樣的話，可能對其產生影響的因素也是比較多的。需要注意的是，在進行多重PCR檢測方法建立的實際過程中，最為關鍵的就是引物的設計，總的來說，引物不僅僅應該具有較強的特異性，而且對于引物的含量應該是大致相同的，解鏈的時候，對于溫度的要求基本是相同的，這樣的話，如果退火溫度相同的話，那么雖然基因的片段不同，但是擴增的效果都是比較理想的。

還有一點必須認識到，就是擴增得到的產物如果經過瓊脂糖凝膠電泳處理之后，分帶是清晰的，也就是說，擴增片段不僅僅存在大小的差異，而且是能夠清晰加以辨別的。

最后就是對于引物之間可能存在的關系，必須予以充分考慮，這樣的話能夠有效避免二級結構的形成，否則就很容易導致多重擴增失敗或者是呈現出假陽性，進而導致錯誤的結果。

對于多重PCR來說，之所以需要對其反應條件進行優化，主要的原因就是為了尋求不同引物濃度在不同的反應體系中的最佳配比，實現引物濃度的平衡，最終保證任意一個靶位點都能夠得到足夠的擴增值。

還有一點就是要想實現多重PCR擴增效率的提升，就要在適當的程度范圍內增加模板的濃度以及聚合酶的濃度，如果擴增的效率并未因此得到改善的話，最好是能夠讓引物的濃度得以成倍增加，主要的舉措就是復性和延伸的溫度依次降低。

如果在實驗的過程中，出現了比較嚴重的非特異性擴增，那么必須首先通過一些常規的方法對引物進行確定，明確是由于哪一對引物的存在而導致的這種非特異性擴增，然后對引物進行重新設計。

事實上，在引物的選擇上，所選擇的三對引物在擴增片段的長度方面，差異并非顯著，通過濃度為1.5%的瓊脂糖電泳就能夠加以區分。既然擴增的片段補償，那么在進行模板制備的時候，選擇水煮法就是可以的。另外，可以選擇適當區間序列作為擴增的目的片段，主要目的就是為了提升PCR的陽性檢出率。

事實上，從臨床的檢測結果來看，如果是對于已經采集到的34份奶樣同時使用傳統方法和二重以及三重檢測方法進行檢測的話，會發現相對于傳統的細菌學方法來說，無論是二重，抑或是三重，檢出的符合率都要更高一些，而且通過PCR方法的檢出率明顯要高于細菌學的檢測方法。

另外，在實驗的過程中發現，如果是對多重PCR反應體系進行優化的話，方法快速、準確、科學，優化的效率得到顯著提升。事實上，能夠對多重的PCR反應產生影響的因素有很多，例如引物的使用量等，研究表明，引物的使用量和產物的大小是成正比例的。

對于奶牛的養殖來說，乳腺炎可以說是一種極為常見的疾病，而且其主要的致病原因就在于多重病原菌對于奶牛乳腺組織的侵襲所導致的，這其中金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌等都是奶牛乳腺炎最為主要的致病菌種，通過對當地幾個規模化奶牛場乳腺炎進行細菌的分離與鑒定，明確這三種菌種在當地牛場的分布情況，再針對三種不同的菌種，依托軟件，立足實際，進行了三對特異性引物的設計，在此基礎上，建立了多重的PCR反應體系，同時對其進行科學和合理的優化，實現多重PCR反應體系效率的顯著改善與提升。

通過實驗發現，運用傳統的方法對細菌進行分離與鑒定，結果發現三種致病病原菌在奶牛場是廣泛的存在的，只是檢出率略有差異，其中無乳鏈球菌檢出率是最高的，金黃色葡萄球菌次之，而酵母菌的檢出率相對于其他兩種菌種而言，是比較低的。在感染的方式方面，金黃色葡萄球菌單獨感染率將近5%，無乳鏈球菌的單獨感染率將近18%，而酵母菌是不會單獨發生感染的，混合感染率則將近78%。

雖然隨著奶牛養殖規模的不斷擴大，當地規模化養殖場的數量日趨增多，但是由于在飼養管理方面依然延續了傳統的、粗放式的手段，再加上長期的擠奶等操作很容易導致乳腺組織處于高負荷的運轉情況下，抵抗力不斷下降，感染的概率大大增加；再加上管理不夠科學，不夠規范，衛生條件不理想，環境細菌超標現象嚴重，可以說都為各種奶牛乳腺炎主要致病菌的生長和繁殖提供了生長與繁殖的條件。

綜上所述，對于奶牛乳腺炎的發病機制以及主要的致病病原菌都有了更加深入、細致的認識和了解，同時在此基礎上，在對各種病原菌進行分離與鑒定的基礎上，針對多重PCR反應體系的建立與優化進行了分析，可以說為今后進一步做好乳腺炎的檢測，提供了一定的依據和參考，為后期進一步做好綜合性防控奠定了堅實、有力的基礎。當然，如果想要降低乳腺炎的發生概率，盡快實現飼養管理的科學化、合理化以及規范化是至關重要的。

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