樹鼩副粘病毒(TPMV)PCR方法的建立及初步應(yīng)用

王淑菁，付 瑞，李曉波，王 吉，賀爭鳴，岳秉飛(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，國家實驗動物質(zhì)量檢測中心， 北京 100050)

目前樹鼩作為一種新型實驗動物資源，在肝炎病毒[1]、EV71病毒[2]、流感病毒[3]等人類病毒研究中應(yīng)用廣泛。樹鼩作為實驗動物，比犬、鼠等更適合于人類相關(guān)疾病的研究[4]。除此以外，從樹鼩中分離得到的樹鼩副粘病毒(Tupaiaparamyxovirus，TPMV)，作為一種新型的溶瘤病毒載體日益受到關(guān)注[5]。將樹鼩副粘病毒進行基因改造后成為溶瘤病毒載體，運用于靶向治療研究中。由于樹鼩副粘病毒不感染人類細(xì)胞，與其他副粘病毒的中和抗體不出現(xiàn)交叉反應(yīng)，這是其他溶瘤病毒如麻疹病毒、腺病毒、皰疹病毒無法比擬的優(yōu)勢[6]。

國內(nèi)文獻報道曾在野生樹鼩中分離得到樹鼩腺病毒[7]、樹鼩呼腸孤病毒[8]，但未曾有樹鼩副粘病毒的分離報道。2010年發(fā)布的云南省實驗樹鼩微生物等級及監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)中也沒有樹鼩副粘病毒的相關(guān)檢測要求[9]。因此，本研究將開展樹鼩副粘病毒的方法建立及應(yīng)用研究。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒

本實驗室無TPMV分離毒種，需要構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為陽性對照。對NCBI上提供的TPMV、麻疹病毒和仙臺病毒進行比對，選擇TPMV基因組中TpVgp5基因保守序列(8231 bp～8720 bp區(qū)域)，人工合成約490 bp DNA目的片段，插入pMD18-T載體，構(gòu)建TPMV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。

1.1.2 病毒

仙臺病毒為本科室保存毒種。

1.1.3 動物樣本

樹鼩樣本來自昆明滇西亞種野生成年樹鼩，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心提供[SCXK (滇) K2013-0001]。采集60份樹鼩呼吸道咽拭子(Ts 1～Ts 60，雌雄各半)以及12份樹鼩肺組織(Tl 1～Tl 12，均為雌性)。動物取樣操作在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心進行[SYXK (滇) K2013-0001]，動物取樣操作依據(jù)實驗動物3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

樣本RNA提取使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction試劑盒(貨號：9767)；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用Promega AMV Reverse Transcriptase試劑盒(貨號：M5108)；PCR反應(yīng)使用TaKaRa Taq Hot Start Version試劑盒(貨號：DR007A)。冷凍離心機：德國Hettich MIKRO 22R；PCR儀：美國ABI公司Veriti 96 well Thermal cycler；核酸瓊脂糖凝膠電泳儀：美國Bio-Rad公司PowerPac Basic；凝膠成像分析儀：美國Kodak公司GL212Pro。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設(shè)計

使用Primer 5設(shè)計引物，上游引物：ATTATTC AAATCCTCCACC；下游引物：CTTCCGTACCACAAA CTG。擴增片段453 bp。由TaKaRa公司合成。

1.3.2 樣本RNA提取

使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction試劑盒提取樣品中RNA。詳細(xì)操作根據(jù)產(chǎn)品說明書。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

反應(yīng)體系：無RNA酶水7 μL，5× buffer 5 μL，dNTP(濃度2.5 mmol/L)4 μL，隨機引物(濃度 500 μg/mL)0.5 μL，RNA 8 μL，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(濃度10 U/μL)0.5 μL，總計25 μL。反應(yīng)條件：37℃ 90 min，72℃ 15 min，4℃ 5 min。

1.3.4 PCR擴增體系及反應(yīng)條件

反應(yīng)體系：10× buffer 2.5 μL，dNTP(濃度2.5 mmol/L)2 μL，dH2O 17.35 μL，上游引物(濃度10 μmol/L)1 μL，下游引物(濃度10 μmol/L)1 μL，cDNA(濃度50 ng/μL)1 μL，Hs Taq酶(濃度5 U/μL)0.15 μL，總計25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 1 min，48℃ 1 min，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。將得到的PCR產(chǎn)物進行電泳，并送TaKaRa公司測序。

1.3.5 考察特異性

仙臺病毒為對照，考察該方法的特異性，并將得到的目的片段測序驗證特異性。

1.3.6 考察靈敏度

使用無菌水稀釋標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，濃度分別為11.5 × 100μg/mL、11.5 × 10-1μg/mL、11.5 × 10-2μg/mL、11.5 × 10-3μg/mL、11.5 × 10-4μg/mL、11.5 × 10-5μg/mL、11.5 × 10-6μg/mL、11.5 × 10-7μg/mL、11.5 × 10-8μg/mL和11.5 × 10-9μg/mL，考察該方法的靈敏度。

1.3.7 初步應(yīng)用

應(yīng)用建立的PCR方法檢測60份樹鼩呼吸道咽拭子和12份樹鼩肺組織中是否存在TPMV病毒感染。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)體系的建立

使用設(shè)計的TPMV特異性引物擴增標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，得到約453 bp目的片段，對該片段直接測序，測序得到414 bp可信序列，BLAST比對結(jié)果顯示測序序列與NCBI公布的樹鼩副粘病毒序列一致率為99%，說明該條帶為目的條帶。

2.2 特異性結(jié)果

仙臺病毒與樹鼩副粘病毒屬于同一種屬病毒，均屬于副粘病毒科，副粘病毒屬。以仙臺病毒做對照，結(jié)果顯示該引物不擴增仙臺病毒，僅擴增TPMV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，得到453 bp目的片段，方法具有特異性。見圖1。

2.3 靈敏度結(jié)果

稀釋TPMV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，濃度分別為11.5 × 100μg/mL、11.5 × 10-1μg/mL、11.5 × 10-2μg/mL、11.5 × 10-3μg/mL、11.5 × 10-4μg/mL、11.5 × 10-5μg/mL、11.5 × 10-6μg/mL、11.5 × 10-7μg/mL、11.5 × 10-8μg/mL和11.5 × 10-9μg/mL，結(jié)果顯示，稀釋至11.5 × 10-5μg/mL仍然有條帶擴增，靈敏度為11.5 × 10-5μg/mL。見圖2。

注：M：100 bp marker；1：陰性對照；2：樹鼩副粘病毒標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；3：仙臺病毒。圖1 特異性實驗Note.M: 100 bp marker; 1: Negative control; 2: TPMV standard plasmid; 3: Sendai virus.Fig.1 Specificity of PCR

注：M：100 bp marker；1：11.5 × 100 μg/mL；2：11.5 × 10-1 μg/mL；3：11.5 × 10-2 μg/mL；4：11.5 × 10-3 μg/mL；5：11.5 × 10-4 μg/mL；6：11.5 × 10-5 μg/mL；7：11.5 × 10-6 μg/mL；8：11.5 × 10-7 μg/mL；9：11.5 × 10-8 μg/mL；10：11.5 × 10-9 μg/mL；11：陰性對照。圖2 靈敏度實驗Note.M: 100 bp marker; 1: 11.5 × 100μg/mL; 2: 11.5 × 10-1μg/mL; 3: 11.5 × 10-2μg/mL; 4: 11.5 × 10-3μg/mL; 5: 11.5 × 10-4μg/mL; 6: 11.5 × 10-5μg/mL; 7: 11.5 × 10-6μg/mL; 8: 11.5 × 10-7μg/mL; 9: 11.5 × 10-8μg/mL; 10: 11.5 × 10-9μg/mL; 11: Negative control.Fig.2 Sensitivity of PCR

2.4 初步應(yīng)用

提取12份樹鼩肺組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行PCR檢測，檢測結(jié)果為陰性對照和陽性對照成立，樣品中無樹鼩副粘病毒核酸檢出。見圖3。

提取60份樹鼩呼吸道咽拭子RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行PCR檢測，結(jié)果為陰性對照和陽性對照成立，樣品中無樹鼩副粘病毒核酸檢出。見圖4～6。

注：M：100 bp marker；1：樹鼩副粘病毒陽性質(zhì)粒；2～13：12份樹鼩肺組織(Tl 1～Tl 12)cDNA。圖3 PCR方法檢測12份樹鼩肺組織(Tl 1～Tl 12)cDNANote.M: 100 bp marker; 1: TPMV standard plasmid; 2-13: cDNA of 12 lung tissues from tree shrews (Tl 1-Tl 12).Fig.3 cDNA of 12 lung tissues from tree shrews (Tl 1-Tl 12) detected by PCR

注：M：100 bp marker；1、23：樹鼩副粘病毒陽性質(zhì)粒；2：陰性對照；3～22：20份樹鼩呼吸道咽拭子(Ts 1～Ts 20)cDNA。圖4 PCR方法檢測20份樹鼩呼吸道咽拭子(Ts 1～Ts 20)cDNANote.M:100 bp marker; 1, 23: TPMV standard plasmid; 2: Negative control; 3-22: cDNA of 20 respiratory swabs from tree shrews (Ts 1-Ts 20).Fig.4 cDNA of 20 respiratory swabs from tree shrews (Ts 1-Ts 20) detected by PCR

注：M：100 bp marker；1、23：樹鼩副粘病毒陽性質(zhì)粒；2：陰性對照；3～22：20份樹鼩呼吸道咽拭子(Ts 21～Ts 40)cDNA。圖5 PCR方法檢測20份樹鼩呼吸道咽拭子(Ts 21～Ts 40)cDNANote.M: 100 bp marker; 1, 23: TPMV standard plasmid; 2: Negative control; 3-22: cDNA of 20 respiratory swabs from tree shrews (Ts 21-Ts 40).Fig.5 cDNA of 20 respiratory swabs from tree shrews (Ts 21-Ts 40) detected by PCR

注：M：100 bp marker；1：樹鼩副粘病毒標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；2：陰性對照；3～22：20份樹鼩呼吸道咽拭子(Ts 41～Ts 60)cDNA。圖6 PCR方法檢測20份樹鼩呼吸道咽拭子(Ts 41～Ts 60)cDNANote.M: 100 bp marker; 1: TPMV standard plasmid; 2: negative control; 3-22: cDNA of 20 respiratory swabs from tree shrews (Ts 41-Ts 60).Fig.6 cDNA of 20 respiratory swabs from tree shrews (Ts 41-Ts 60) detected by PCR

3 討論

樹鼩副粘病毒(TPMV)是1999年首次由Tidona等人從曼谷捕獲的健康野生樹鼩的腎組織中，分離得到病原體，隨后在樹鼩成纖維細(xì)胞和樹鼩腎細(xì)胞中培養(yǎng)增殖[10]。由于其在電鏡下呈副粘病毒樣多形性包膜和螺旋樣核衣殼，因此被命名為樹鼩副粘病毒。樹鼩副粘病毒RNA序列為17904 bp，包括兩個不重疊的開放讀碼框架(對應(yīng)為N蛋白和P/V/C蛋白)。氨基酸序列同源性分析顯示樹鼩副粘病毒和麻疹病毒屬之間存在進化關(guān)系，尤其是樹鼩副粘病毒和亨德拉病毒(馬麻疹病毒)發(fā)現(xiàn)有高同源性。樹鼩副粘病毒與目前已知的副粘病毒均無血清學(xué)交叉反應(yīng)，由于這一血清學(xué)特性，目前被作為溶瘤病毒載體進行基因改造，運用于靶向殺死癌癥細(xì)胞研究，具有廣闊的臨床價值[11]。

目前國內(nèi)無TPMV病毒分離的報道，沒有標(biāo)準(zhǔn)毒種，所以研究中構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，模擬TPMV病毒。根據(jù)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒序列，設(shè)計特異性引物進行擴增，建立了TPMV PCR檢測方法，考察方法的特異性和靈敏度，結(jié)果顯示該方法僅擴增TPMV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，靈敏度可至11.5 × 10-5μg/mL。應(yīng)用該方法對60份樹鼩呼吸道咽拭子cDNA及12份樹鼩肺組織cDNA檢測，無TPMV目的條帶擴出，說明該病毒在本次采集到的樹鼩中感染率較低，采集樣本量的增加和采集地點的擴大，將有助于研究該病毒的感染情況以及感染規(guī)律。本研究建立的方法，靈敏度高，特異性好，為野生樹鼩病原體的篩查和實驗樹鼩的常規(guī)檢測提供了技術(shù)支撐。

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