口腔鱗狀細胞癌病人唾液的代謝組學研究

(青島大學口腔醫學院，山東 青島 266003)

口腔惡性腫瘤是頭頸部最常見的惡性腫瘤，其中90%以上為鱗癌，以口腔鱗狀細胞癌(OSCC)最為常見，發病率占全身惡性腫瘤的第6位[1]。目前，治療OSCC的首選方法仍是綜合序列治療，治療后易復發，預后并不樂觀。研究表明，早期診斷并經過治療后的口腔鱗癌病人5年生存率可超過80%[2]。但近一半的病人初診時病情已是中晚期，并伴有淋巴轉移[3]，故5年生存率僅為50%左右[4]。分子生物學研究證實，OSCC的發生發展是一個多步驟過程[5]，包括基因突變、上皮單純性增生、上皮異常增生、原位癌、浸潤癌等。目前臨床上對于OSCC的診斷主要是基于組織病理檢查，沒有無創、便捷、靈敏的診斷方法。代謝組學是近幾年興起的一項研究技術，與腫瘤表型特征關系較基因組學和蛋白組學更為緊密[6-8]。目前正在研究應用于各種腫瘤發展過程中的代謝標志物，以期實現對癌癥的早篩選、早發現、早診斷、早治療，這將對降低癌癥的發病率和死亡率有著重要的意義。本文研究應用氣相色譜-飛行時間質譜(GC-TOF-MS)代謝組學技術，對臨床已確診的OSCC病人和健康人的唾液進行代謝輪廓的研究，尋找與OSCC相關的潛在代謝標志物，并通過代謝通路對其進行討論。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

甲醇(CNW Technologies公司，德國)；氯仿、吡啶(Adamas公司，中國)；甲氧銨鹽(TCI公司，日本)；L-2-氯苯丙氨酸(上海恒柏生物科技)；BSTFA(REGIS Technologies公司，美國)；飽和脂肪酸甲酯(Dr. Ehrenstorfer公司，德國)；7890A型氣相色譜(Agilent公司，美國)；PEGASUS HT型質譜儀(LECO公司，美國)；DB-5MS型色譜柱(Agilent公司，美國)；Heraeus Fresco17型離心機(Thermo Fisher Scientific公司，美國)；TNG-T98型真空干燥儀(華美生化儀器廠)；唾液采集管(SARSTEDT公司，德國)。

1.2 研究對象與分組

青島大學附屬醫院口腔頜面外科和口腔黏膜病科OSCC病人26例，男16例，女10例；年齡34～84歲，平均(59.8±11.9)歲。樣本采集均征得病人本人同意，并由術前病理檢查確定診斷。以20例健康志愿者作為正常對照組，男8例，女12例；年齡30～76歲，平均(57.6±11.8)歲。兩組性別、年齡比較差異無顯著性(P>0.05)。樣本采集前確保所有捐獻者口腔黏膜均無其他疾病并否認全身系統性疾病，半年內未服用免疫抑制劑，未行化療。所有研究對象均填寫知情同意書，并經倫理委員會審核同意。

1.3 研究方法

1.3.1唾液樣本收集及代謝物提取 收集唾液樣本前告知病人2 h內禁食、禁飲、禁煙。根據NAVAZESH的方法[9]，在上午9:00～11:00收集研究對象唾液樣本于唾液采集管中，2 000 r/min離心5 min，得到純凈的唾液樣本，置于-80 ℃保存。取200 μL唾液樣本加入0.3 mL提取液(甲醇)以及20 μL的L-2-氯苯丙氨酸，渦旋30 s，研磨儀處理4 min，冰浴超聲5 min；于4 ℃、13 000 r/min離心20 min；取0.4 mL上清液于2 mL進樣瓶(甲烷硅基化)中，每個樣本各取70 μL混合成質控(QC)樣本；干燥提取物，加入20 μL甲氧胺鹽試劑(甲氧胺鹽酸鹽，溶于20 g/L吡啶中)，放入80 ℃烘箱中30 min；分別向每個樣品中加入30 μL的BSTFA(含有體積分數0.001的TMCS)，將混合物70 ℃孵育1.5 h；冷卻至室溫，加入5 μL飽和脂肪酸甲酯C8-C16(1 g/L)和C18-C24(0.5 g/L)；隨機順序上機檢測。

1.3.2GC-TOF-MS數據采集 GC條件：DB-5MS毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)，進樣口溫度280 ℃，離子源溫度250 ℃，以氦氣作為載氣，前進氣流量2 mL/min，氣體流量1 mL/min，不分流，進樣量2 μL。柱箱升溫程序：初始溫度50 ℃(保持1 min)，以10 ℃/min升至310 ℃(保持8 min)。MS條件：電子轟擊離子源溫度250 ℃，電子能量70 eV，接口溫度270 ℃，全掃描模式下在50～500 m/z范圍內以每秒20個光譜的速率在溶劑延遲6.27 min后獲得質譜數據。

1.4 數據處理

運用四分位數間距對數據偏離值進行過濾，對原始數據的缺失值進行模擬，用內標歸一法對數據進行標準處理。數據預處理后，使用SIMCA軟件進行多元變量模式識別分析，運用主成成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)法對結果進行建模分析，對模型有效性進行評判；最后通過置換檢驗對模型有效性做進一步的檢驗。

1.5 差異代謝物的篩選及鑒定

根據OPLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度(VIP)>1、Student’st檢驗的P值(P<0.05)尋找差異性代謝標志物；通過檢索LECO-Fiehn Rtx5數據庫對所尋找到的代謝標志物進行質譜匹配及保留時間指數匹配，最后使用標準品驗證結果。

2 結 果

2.1 GC-TOFMS數據分析結果

OSCC組和正常對照組的唾液樣本初步檢測出530個峰,數據經過過濾、標準化處理、利用內標(IS)進行歸一化，334個峰被保留。兩組樣本的典型離子流色譜圖見圖1。為了區分OSCC組和正常對照組，對所有唾液樣品的實驗數據進行OPLS-DA建模分析，結果見圖2。由圖2可見，OSCC組與正常對照組表現出明顯的分離趨勢，說明兩組代謝譜間存在著明顯差異。置換檢驗證明模型可靠，解釋模型的參數R2Y=0.858，表示模型預測能力的參數Q2=0.322，且無過擬合現象[10]。

2.2 差異代謝物鑒定結果

經鑒定最終確定6個代謝差異物，包括尿酸、核糖、酪氨酸、植物鞘氨醇、二氫神經鞘氨醇、對羥基乳酸。見表1。通過對以上得到的差異代謝物進行層次聚類分析，并以熱力圖展示[11]，見圖3?？梢郧宄赜^察到6個代謝標志物中，只有酪氨酸在OSCC組濃度較高，其余5個代謝標志物在OSCC組濃度均較低，在正常對照組濃度均較高。見圖4。

3 討 論

代謝組學是通過觀察生物體受刺激或擾動后其代謝產物的變化或代謝產物隨時間的變化，來研究生物體代謝途徑的一種技術。過去10年中，代謝組學在乳癌、胰腺癌、鼻咽癌等癌癥的早期診斷中都有應用，并受到全球范圍內的關注[12]。有研究證實，即使對于癌癥早期和相對較小的腫瘤來講，其代謝譜與健康人群的差異也是非常明顯的。提示癌癥具有全身性的代謝反應[13]。由于唾液樣本收集無創傷、易采集、與病人有良好的合作、沒有收集地點的限定、檢測敏感等優點，更易被受試者接受[14]。

表1 經實驗鑒定的OSCC組區別于正常對照組的差異代謝物

圖1 兩組唾液樣本典型離子流色譜圖

橫坐標t[1]P表示第一主成分的預測主成分得分，縱坐標t[1]O表示正交主成分得分，散點形狀和顏色表示不同的實驗分組。

橫坐標C代表OSCC組，B代表正常對照組，不同的色塊代表對應位置代謝物的相對表達量。

亮藍色標記點為濃度下降趨勢，亮紅色標記點為濃度升高趨勢。

本研究采用GC-TOF-MS的代謝組學方法對OSCC組與正常對照組的唾液樣本進行分析，找出并鑒定了6種生物標記物，分別為尿酸、核糖、酪氨酸、植物鞘氨醇、二氫神經鞘氨醇、對羥基乳酸。據Warburg Effct效應，與正常細胞不同，腫瘤細胞主要通過糖酵解作用而產生能量。在有氧的條件下，葡萄糖經過糖酵解作用逐步分解生成乙酰輔酶A進入三羧酸循環(TCA)，TCA不僅是三大類物質(糖類、脂類、蛋白質)的最終代謝通路，也是糖類、脂類、蛋白質代謝甚至核酸代謝的聯系樞紐。本實驗從熱力圖中可以直觀觀察到酪氨酸在OSCC組高表達，酪氨酸是由蛋白質代謝產物苯丙氨酸轉換而成。腫瘤病人體內蛋白質代謝較為復雜，總體表現為蛋白質分解增加超過合成增加。作為蛋白質代謝的中間產物，氨基酸的代謝也呈明顯紊亂，因此酪氨酸作為其分解代謝產物在OSCC病人唾液中濃度呈增高趨勢。有動物實驗表明，體內及體外去除苯丙氨酸/酪氨酸均可以抑制腫瘤細胞的增殖，使腫瘤細胞阻止于G0/G1期，同時可以降低周期素D1的表達[15]。由此推測，體內酪氨酸與腫瘤有一定的相關性。本文酪氨酸代謝通路分析顯示，在該通路里酪氨酸經過谷氨酸草酰轉氨酶(2.6.1.1)和酪氨酸轉氨酶(2.6.1.5)的協同作用后，共同調控其代謝產物對羥基乳酸，從而使對羥基乳酸的含量呈現下調趨勢。

本文結果顯示，OSCC唾液二氫神經鞘氨醇和植物鞘氨醇濃度均呈下調趨勢，這與WANG等[16]的研究結果相似。二氫神經鞘氨醇和植物鞘氨醇均與神經酰胺的合成和代謝有關，神經酰胺為鞘脂的代謝產物，被認為是誘導細胞凋亡的重要細胞信號，參與調節細胞的生長、分化、衰老和細胞程序性死亡等許多重要的信號轉導過程。脂代謝紊亂與腫瘤的發生與轉移有一定的關系。惡性腫瘤細胞增殖時，膽固醇的攝取量增多、合成加速。二氫神經鞘氨醇作為抑制低密度脂蛋白誘導膽固醇酯化的阻滯劑，引起未酯化的膽固醇積聚在細胞核周區；同時，植物鞘氨醇在結構上類似于鞘氨醇。因此，OSCC病人唾液中二氫神經鞘氨醇和植物鞘氨醇濃度均呈下調趨勢。提示這些具有生物活性的鞘脂代謝物有望成為OSCC的生物標志物。

尿酸是由核酸的中間代謝產物嘌呤核苷酸在黃嘌呤作用下轉換而成。其中，嘌呤核苷酸在機體的能量供應和代謝調節等方面都有十分重要的意義。核酸作為生命活動的基本物質之一，儲存在人體細胞的細胞核和線粒體中，由RNA和DNA兩部分構成，在機體的生長和遺傳等生命活動過程中起著至關重要的作用。在腫瘤病人核酸代謝的過程中，DNA和RNA聚合酶活性均較正常組織高，由于核酸代謝明顯降低，從而導致尿酸濃度也明顯降低，因此，尿酸的濃度在OSCC病人唾液中呈下調趨勢。核糖是核酸的基本構成單位，其濃度在OSCC病人唾液中也呈現下調的趨勢。本實驗結果從代謝角度提示尿酸和核糖作為OSCC代謝標志物的潛在可能性。

綜上所述，應用代謝組學研究方法，從OSCC病人唾液中成功篩選出6種口腔鱗癌唾液代謝標志物；相關代謝通路分析顯示，OSCC病人與健康人群相比存在著氨基酸代謝和能量代謝紊亂以及脂類代謝失衡的現象，還表現出TCA異常。由于本實驗樣本數量有限，導致了此次實驗的局限性，因此本實驗結果還需要通過更多的實驗樣本進行驗證，若今后研究同時結合血液樣本和尿液樣本，可以得到更加完善的代謝圖譜，這將為OSCC的診斷提供可靠的代謝證據，為將來的臨床工作提供有效的幫助。

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