銅對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤生長及肝功能和免疫功能的影響

(1 青島大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 青島 266021； 2 青島市標(biāo)準(zhǔn)化研究院)

銅是一種非常重要的微量元素。它不僅參與蛋白質(zhì)、核酸、脂肪、碳水化合物、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，而且在人體骨骼發(fā)育、生殖、凝血等生理功能中起著重要的作用。然而，環(huán)境重金屬污染已成為全球問題，環(huán)境銅污染也日趨嚴(yán)重。銅是工業(yè)中常用的重金屬，一項(xiàng)對(duì)電子垃圾拆除中心周圍居住人群的血清銅和尿銅的研究檢測結(jié)果顯示，暴露組人群和對(duì)照組人群的血清銅和尿銅水平均有顯著差異[1]。同時(shí)，銅具有的促生長和殺菌作用，使得人們在畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)上大量使用銅相關(guān)制劑[2-4]。銅蓄積或代謝異常可以導(dǎo)致WILSON病[5]和MENKE病[6]，銅過載與神經(jīng)性疾病如阿爾茨海默病(AD)等疾病的發(fā)生也有關(guān)系[7-8]。近年來，隨著腫瘤研究的深入，銅與腫瘤的關(guān)系也逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，銅可能是影響人類腫瘤生長的重要因素。臨床流行病學(xué)調(diào)查顯示，部分癌癥病人血清銅含量明顯高于健康人群，與腫瘤的發(fā)生間存在著相關(guān)性，如口腔癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌、肺癌和腦瘤等[9-14]，并且適量的銅缺乏是能夠抑制腫瘤發(fā)生的[15-16]。本實(shí)驗(yàn)在前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，通過建立H22荷瘤小鼠的模型，選擇適量的銅濃度給小鼠灌胃，觀察銅對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤生長及肝功能和免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來源及分組

SPF級(jí)昆明小鼠80只，體質(zhì)量18～22 g，購于山東魯抗藥業(yè)公司(許可證號(hào)scxk(魯)20140007)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為灌胃給水組(A組)，灌胃給水+四硫鉬酸銨鹽(TM)組(B組)，分別灌胃給予0.06、0.3、1.5 mg/kg硫酸銅組(C、D、E組)，分別灌胃給予0.06、0.3、1.5 mg/kg硫酸銅+1 mg/kg TM組(F、G、H組)，每組10只小鼠，小鼠每日自由進(jìn)水、進(jìn)食。

1.2 各組處理與模型制備

根據(jù)上述的分組，用不同濃度的硫酸銅溶液給小鼠灌胃4周，使小鼠體內(nèi)獲得一定量的銅蓄積。隨后，將H22腹水瘤細(xì)胞接種于小鼠右腿部，建立H22肝癌小鼠移植瘤模型(抽取H22腹水瘤小鼠的腹水，在顯微鏡下通過錐蟲藍(lán)染色計(jì)數(shù)(>95%)，通過PBS將細(xì)胞數(shù)調(diào)至1×109/L。隨后，以每只5×109個(gè)細(xì)胞/L接種在小鼠的右后腿)。然后，根據(jù)相應(yīng)的分組及硫酸銅繼續(xù)持續(xù)灌胃4周。9周后，將全部小鼠處死，眼球取血。取出移植瘤及肝、脾、胸腺等臟器并稱量。

1.3 觀察指標(biāo)及測定方法

1.3.1腫瘤發(fā)生情況及體積變化 在接種腫瘤后，每3 d測量一次腫瘤的長和寬并記錄，根據(jù)公式計(jì)算瘤體積(V)，公式如下：V=長×寬×寬/2。

1.3.2肝功能及脾臟和胸腺指數(shù)計(jì)算 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠禁食12 h。眼球取血后，取小鼠的胸腺和脾臟并稱量，通過公式計(jì)算出小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)。公式如下：胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/(小鼠體質(zhì)量×10)，脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/(小鼠體質(zhì)量×10)

1.3.3ICP-MS檢測血清銅的含量 取血清0.2～0.5 g。將試樣置于聚四氟乙烯消解罐中，然后加入6 mL硝酸，再加入1 mL過氧化氫，蓋上密封蓋，放入微波消解儀中消解，程序?yàn)樯郎刂?00 ℃，后加熱時(shí)間10 min,控制溫度200 ℃，持續(xù)時(shí)間20 min，冷卻時(shí)間30 min。隨后按照儀器操作規(guī)程，調(diào)整儀器至最佳狀態(tài)。待儀器穩(wěn)定后，按順序依次對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白溶液和試樣進(jìn)行測定。所得結(jié)果按照以下公式進(jìn)行計(jì)算：X=c×10/m×1000 (X:銅含量，c:當(dāng)前試樣銅濃度，m: 試樣質(zhì)量)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)mRNA的表達(dá)

利用Trizol提取腫瘤組織中的mRNA，用痕量核酸儀檢測mRNA的濃度和純度。隨后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用PCR儀檢測VEGF和bFGF的表達(dá)。檢測條件如下：95℃預(yù)變性5 min；然后95℃變性10 s,60 ℃退火30 s，共進(jìn)行50個(gè)循環(huán)。引物序列：bFGF F：5′-ACGG-CTGCTGGCTTCTAAGT-3′，R：5′-CAGTGCCA-CATACCAACTGGA-3′；VEGF F：5′-CACCAAA-GCCAGCACATAGG-3′，R：5′-ACCCTTTCCCTT-TCCTCGAA-3′。

2 結(jié) 果

2.1 各組H22荷瘤小鼠體質(zhì)量及腫瘤的生長變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，A、B、C組和F組各有1只小鼠死亡，D組中有2只小鼠死亡，E組和H組中有3只小鼠死亡，G組中有4只小鼠死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與A、F、G、H組相比，D、E組腫瘤均有不同程度的增長，差異具有顯著意義(F=9.034，P<0.05)。見表1。

2.2 各組小鼠肝功能指標(biāo)及胸腺、脾臟指數(shù)比較

各組小鼠AST、ALT、ALB及胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3 各組小鼠血清銅水平

A～E組血清銅水平分別為(1.43±0.20)、(1.39±0.17)、(1.55±0.22)、(1.64±0.48)、(1.92±0.27)、(1.51±0.35)、(1.23±0.15)、(1.51±0.35)mg/kg，E組血清銅水平與A組相比顯著增高，差異有顯著性(F=3.803,P<0.05)。

2.4 血清銅與腫瘤質(zhì)量的相關(guān)性分析

隨機(jī)抽取32例血清樣本，檢測結(jié)果顯示，血清銅的水平平均為(1.51±0.35)mg/kg，腫瘤質(zhì)量平均為(3.84±1.11)g，血清銅水平與腫瘤質(zhì)量具有相關(guān)性(r=0.316，P<0.05)。

2.5 各組小鼠腫瘤組織中VEGF和bFGF mRNA表達(dá)水平比較

A～E組腫瘤組織中VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.29±0.004、0.02±0.001、0.26±0.011、0.34±0.012、0.39±0.016、0.06±0.046、0.01±0.001、0.01±0.001；A～E組小鼠腫瘤組織中bFGFmRNA表達(dá)水平分別為0.28±0.016、0.02±0.001、0.15±0.007、0.25±0.051、0.92±0.27、0.02±0.014、0.04±0.003、0.01±0.001。C、D、E組與A組相比，腫瘤組織中VEGF和bFGF mRNA表達(dá)水平升高，差異有顯著性(F=40.118、197.090,P<0.05)。

表1 各組H22荷瘤小鼠體質(zhì)量及瘤質(zhì)量的變化

表2 各組小鼠肝功能指標(biāo)及胸腺、脾臟指數(shù)比較

3 討 論

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)全國第3次死因回顧性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤中，原發(fā)性肝癌引起的死亡人數(shù)已從第3位升高到第2位[17]，嚴(yán)重危害著我國居民的健康，給人類造成了巨大的疾病負(fù)擔(dān)。

肝癌的發(fā)生是多因素、多途徑、多步驟長期作用的結(jié)果，但病因機(jī)制尚未完全闡明，肝癌的預(yù)防仍然是臨床上的難題。肝臟作為銅蓄積的主要器官，當(dāng)銅的蓄積超過肝臟代謝的閾值時(shí)，會(huì)損害肝細(xì)胞，引起多種疾病，如WILSON病[5]和MENKE病[6]。銅過量可引起細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，從而產(chǎn)生活性氧(ROS)，ROS可以造成脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA損傷。ROS同時(shí)也是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要因素[18]。研究顯示，肝對(duì)銅負(fù)載會(huì)啟動(dòng)自身的保護(hù)機(jī)制，即使沒有發(fā)生臨床、生化和形態(tài)上的變化，肝細(xì)胞中HGFb和NF-κB的表達(dá)也會(huì)增加，進(jìn)而增加肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)[19]。以往有關(guān)銅的研究多是選擇超過機(jī)體可承受范圍多倍的銅濃度，用以觀察高銅對(duì)動(dòng)物的毒性作用；而有關(guān)機(jī)體可承受的銅濃度對(duì)機(jī)體的作用主要集中在體外細(xì)胞系的研究。但是，人類在現(xiàn)實(shí)生活中接觸高濃度銅的機(jī)會(huì)卻很少。所以本實(shí)驗(yàn)研究所采用的銅和TM的劑量，是根據(jù)中國營養(yǎng)學(xué)會(huì)(CNS)建議的成人銅的適宜攝入量(AI)為2 mg/d，最高可耐受攝入量(UL)為8 mg/d計(jì)算出來的。當(dāng)成人每日攝入0.8～7.5 mg銅時(shí)，機(jī)體中的血漿銅濃度、紅細(xì)胞超氧化物歧化酶、血漿銅藍(lán)蛋白和尿銅無明顯變化[20]；當(dāng)機(jī)體攝入1 mL的TM時(shí)，可以降低人體20%的血銅，既有效地抑制促血管發(fā)生因子的釋放，又不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生副作用，機(jī)體也能長期耐受[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組小鼠肝功能血清理化指標(biāo)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明本實(shí)驗(yàn)所選用的銅和TM的濃度在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)未對(duì)小鼠的肝臟和免疫系統(tǒng)造成損傷。

多數(shù)腫瘤的生長需要銅離子的參與[22]，長期飲用高銅濃度(公眾供水系統(tǒng)中規(guī)定的最高含量)的水能加速癌細(xì)胞的生長[23]。這些研究提示，銅可能是影響腫瘤生長的重要因素。腫瘤細(xì)胞的高增殖速率相比于正常形態(tài)功能的細(xì)胞來說，需要更多的銅離子來滿足其對(duì)生長、增殖所需的環(huán)境條件要求。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著銅濃度的升高，H22荷瘤小鼠的腫瘤的大小和體積也隨之增加，呈劑量反應(yīng)關(guān)系；血清銅水平也隨銅濃度的增加而升高，并與腫瘤質(zhì)量具有相關(guān)性，這與銅和乳腺癌關(guān)系的研究結(jié)果相一致[24]。

腫瘤生長需要許多因素的參與，腫瘤中血管的生成也是腫瘤生長的眾多重要因素之一。腫瘤細(xì)胞不僅能夠分泌血管生長因子，而且能夠促進(jìn)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。腫瘤血管是由血管生成因子的釋放所介導(dǎo)的，血管生成因子主要包括VEGF、bFGF和TGF等，其中，VEGF是被認(rèn)為最重要的血管生成因子[25]，VEGF信號(hào)通路在血管生成的全過程中發(fā)揮不可替代的作用。已有的研究表明，在血管生成的過程中，VEGF通過多種途徑參與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移等[26-27]。bFGF是最強(qiáng)的腫瘤血管生長因子，其異常表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖、惡性轉(zhuǎn)化以及腫瘤形成[28]。為了深入探討銅和TM對(duì)H22移植瘤中VEGF和bFGF的影響，本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR方法檢測了腫瘤組織中VEGF和bFGF mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，隨著銅濃度的增加，腫瘤組織中VEGF和bFGF mRNA表達(dá)有了明顯的上調(diào)，而加入TM組腫瘤組織中VEGF和bFGF mRNA的表達(dá)逐漸降低。這一結(jié)果與RIGIRACCIOLO等[22]的研究一致。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過建立H22荷瘤小鼠模型，在銅和TM的作用下觀察腫瘤的生長情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，銅能夠促進(jìn)腫瘤的生長，其機(jī)制可能是通過上調(diào)腫瘤組織中VEGF和bFGF mRNA的表達(dá)，從而達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用，但仍需要進(jìn)一步的深入研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為肝癌的預(yù)防提供了參考，同時(shí)也為防治銅污染提供了證據(jù)。

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