銀杏內酯B對心肌缺血再灌注心律失常大鼠的作用及機制研究*

柴麗娜 杜 蕊 張艷艷

（1.河北省邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056001；2.冀中能源峰峰集團總醫院，河北 邯鄲056200）

心律失常（arrhythmia）是心肌缺血再灌注后常見并發癥，室性心動過速（VT）和心室顫動（VF）是其主要表現形式，嚴重者甚至危及生命［1]，有效防治心律失常已經成為減輕心肌缺血再灌注損傷的研究熱點。銀杏內酯B（GB）是中藥銀杏葉的主要活性成分之一，既往研究發現銀杏內酯B能夠通過抑制氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡而對心肌缺血再灌注損傷起到一定的保護作用［2-4]，但關于銀杏內酯B影響心肌缺血再灌注性心律失常的文獻報道尚不多見。本實驗于2017年8月至9月間開展，2017年10月至11月完成數據的統計與論文的撰寫。本課題組通過結扎冠狀動脈前降支建立心肌缺血再灌注性心律失常大鼠模型，以維拉帕米為陽性對照藥物，探討銀杏內酯B對心肌缺血再灌注性心律失常的作用及其可能的機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級雄性SD大鼠，8周齡，220～260 g，購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK（冀）2013-1-003。 飼養環境：23～25 ℃、相對濕度55%～60%，適應性飼養1周后進行實驗。

1.2 藥物與試劑 銀杏內酯B購自美國Sigma公司（批號：33570）；維拉帕米注射液購自上海禾豐制藥有限公司 （批號：43170116）；SOD、GSH-Px、MDA、Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號：170113、161217、161029、160815、161010）；鈣標準液（上海生物制品研究所）。

1.3 主要儀器 動物呼吸機（X-300型，成都泰盟儀器廠）；三道心電圖機（XD-30C型，上海醫用電子儀器廠）；紫外-可見分光光度計（上海圣科儀器設備有限公司）；原子吸收光度計（WFD-Y2型，北京第二光學儀器廠）。

1.4 分組與造模 將120只實驗用大鼠按隨機數字表法隨機分為假手術組、模型組、維拉帕米2.5mg/（kg·d）組與銀杏內酯 B 低、中、高劑量組［15、30、60mg/（kg·d）]，每組各20只。銀杏內酯B各劑量組和維拉帕米組分別連續腹腔注射給藥7 d，每日1次，假手術組和模型組給予18mg/（kg·d）0.9%氯化鈉注射液。最后1次給藥2 h后，參照睢大員等［5]報道的實驗方法，通過結扎冠狀動脈前降支建立心肌缺血再灌注性心律失常大鼠模型，結扎30 min后恢復再灌注，假手術組行手術通路但不結扎冠狀動脈前降支，連接Ⅱ導聯心電圖實施監測。造模成功的判斷［6]：心電圖示ST段抬高、心肌局部變蒼白示結扎成功；蒼白心肌恢復紅潤、ST段抬高恢復1/2以上示再灌注成功。再灌注60 min后行各指標檢測。

1.5 監測指標 全程實施Ⅱ導聯心電圖監測，再灌注60min后記錄各組大鼠心電圖PR間期、QRS間期、ST段變化；觀察并計算VT、VF的發生率；心律失常評分方法［7]：未發生或＜5次室性前期收縮，計 0分；僅≥5次室性前期收縮，計1分；僅＜60s室性心動過速，計2分；一陣≥60 s或多陣累計＜60 s室性心動過速，計3分；多陣VT累計＞60 s，計4分；出現VF計5分。

1.6 標本采集與檢測 1）心肌組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性及Ca2+濃度檢測。麻醉后，開胸取心臟組織，于4℃環境剪碎、加入適量冷裂解液后研磨勻漿，制備10%組織勻漿液，3500 r/min離心10 min取上清液，按照各檢測試劑盒操作方法，通過紫外-可見分光光度計檢測心肌組織中Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性；心肌細胞內Ca2+濃度以Ca2+標準液為標準對照，通過原子吸收光度計測定。2）心肌組織抗氧化酶（SOD、GSH-Px）活性及MDA含量檢。取上述步驟制備好心肌組織勻漿液，按照各檢測試劑盒操作方法，通過紫外-可見分光光度計檢測SOD、GSH-Px活性及MDA含量。

1.7 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗，計數資料采用采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠心電圖PR間期、QRS間期、ST段變化比較 見表1。與假手術組比較，模型組大鼠PR間期、QRS間期顯著縮短而ST段明顯抬高（P＜0.01）；與模型組比較，銀杏內酯 B 30、60mg/（kg·d）組和維拉帕米2.5mg/（kg·d）組 PR 間期、QRS 間期顯著延長且 ST 段抬高程度顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組大鼠心電圖PR間期、QRS間期、ST段變化比較（±s）

表1 各組大鼠心電圖PR間期、QRS間期、ST段變化比較（±s）

與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

組 別 n ST段（mV）假手術組 20 0.23±0.04模型組 20 0.53±0.07**銀杏內酯 B 15mg/（kg·d）組 20 0.50±0.08 PR 間期（ms） QRS間期（ms）44.74±4.84 32.36±2.92 31.81±4.63** 21.04±2.68**33.94±4.99 22.47±2.57銀杏內酯 B 30mg/（kg·d）組 20 0.42±0.08△36.48±5.27△ 25.88±3.01△銀杏內酯 B 60mg/（kg·d）組 20 36.89±5.30△ 27.76±3.35△△ 0.34±0.05△△維拉帕米 2.5mg/（kg·d）組 20 36.06±4.85△ 26.34±2.80△ 0.35±0.07△△

2.2 各組大鼠心律失常發生率比較 見表2。與假手術組比較，模型組大鼠VT、VF發生率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，銀杏內酯 B 30、60mg/（kg·d）組和維拉帕米 2.5 mg/（kg·d） 組大鼠 VT、VF發生率顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3 各組大鼠心律失常評分比較 見表3。與假手術組比較，模型組大鼠心律失常評分顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，銀杏內酯 B 30、60mg/（kg·d）組和維拉帕米 2.5mg/（kg·d）組大鼠心律失常評分顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組大鼠VT、VF發生率比較n（%）

表3 各組大鼠心律失常評分比較（分，±s）

表3 各組大鼠心律失常評分比較（分，±s）

組 別 n假手術組 20模型組 20銀杏內酯 B 15mg/（kg·d）組 20心律失常評分0.00±0.00 4.28±1.02**4.13±1.14銀杏內酯 B 30mg/（kg·d）組 20 3.27±0.82△銀杏內酯 B 60mg/（kg·d）組 20 2.04±0.49△△維拉帕米 2.5mg/（kg·d）組 20 2.43±0.55△△

2.4 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性及Ca2+濃度比較 見表4。與假手術組比較，模型組大鼠Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性顯著降低而Ca2+濃度顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較， 銀杏內酯 B 30、60mg/（kg·d） 組和維拉帕米2.5 mg/（kg·d） 組 Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性均顯著升高且Ca2+濃度顯著降低 （P＜0.05或P＜0.01）。

表4 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性及 Ca2+濃度比較（±s）

表4 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性及 Ca2+濃度比較（±s）

Ca2+-Mg2+-ATPase［μmol/（mg·h）]4.07±0.98 4.31±1.15 2.46±0.52** 2.28±0.36**2.75±0.70 2.59±0.57△銀杏內酯 B 30mg/（kg·d）組 20 4.58±1.42△△組 別 n Ca2+（mmol/L）假手術組 20 2.63±0.81模型組 20 6.44±1.72**銀杏內酯 B 15mg/（kg·d）組 20 5.79±1.85 Na+-K+-ATPase［μmol/（mg·h）]3.04±0.61△ 2.86±0.60△銀杏內酯 B 60mg/（kg·d）組 20 3.55±0.87△△ 3.97±1.12△△ 3.03±0.68△△維拉帕米 2.5mg/（kg·d）組 20 3.12±0.68△ 3.04±0.75△ 4.17±0.95△

2.5 各組大鼠心肌組織抗氧化酶活性和MDA含量比較 見表5。與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織抗氧化酶SOD、GSH-Px活性顯著降低而MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，銀杏內酯 B 30、60 mg/（kg·d）組 SOD、GSH-Px活性顯著升高且 MDA 含量顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），維拉帕米 2.5 mg/（kg·d）組SOD活性顯著升高且MDA含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表5 各組大鼠心肌組織抗氧化酶活性和MDA含量比較（±s）

表5 各組大鼠心肌組織抗氧化酶活性和MDA含量比較（±s）

組 別 n MDA（nmol/mg）假手術組 20 3.68±0.75模型組 20 9.51±1.63**銀杏內酯 B 15mg/（kg·d）組 20 8.19±1.57 SOD（U/mg）GSH-Px（U/mg）67.37±8.32 61.46±7.43 46.87±5.96** 45.30±5.62**49.70±6.27 49.75±5.76銀杏內酯 B 30mg/（kg·d）組 20 6.52±1.28△△54.01±7.03△ 57.59±6.30△銀杏內酯 B 60mg/（kg·d）組 20 64.99±9.15△△ 59.06±7.84△ 4.84±1.03△△維拉帕米 2.5mg/（kg·d）組 20 55.28±6.30△ 53.40±6.26 6.17±1.25△△

3 討 論

使冠狀動脈再通、恢復血流再灌注是治療缺血性心臟病的首選方案，但缺血再灌注損傷并發癥嚴重影響著患者預后，尤其再灌注性心率失常是導致心肌梗死患者早期死亡的主要原因［8-9]，因此開發抗缺血再灌注性心率失常藥物具有重要意義。

維拉帕米為臨床治療心律失常常用藥物，能夠通過阻滯鈣離子通道而達到抑制心肌缺血性心律失常的作用［10]，因此本實驗選擇維拉帕米作為陽性對照藥物。銀杏葉為銀杏科銀杏屬多年生落葉喬木銀杏的葉，是我國傳統中藥品種，《本草綱目》和《中藥志》中均有記載，其性味甘苦澀平，具有益心斂肺、化濕止瀉之功效。現代藥學研究發現，萜內酯類化合物為銀杏葉的主要有效成分，包括銀杏內酯（Ginkgolide）A、B、C、M 和白果內酯，其中活性最強的即為銀杏內酯B（Ginkgolide B，GB）。本實驗采用結扎冠狀動脈前降支的方法建立心肌缺血再灌注性心律失常大鼠模型，術前7 d（每日1次）腹腔注射給予銀杏內酯B進行干預，研究發現經銀杏內酯B 30～60mg/kg預處理能夠有效延長心肌缺血再灌注性心律失常大鼠心電圖PR間期、QRS間期并降低ST段抬高程度，降低VT、VF發生率，降低心律失常評分，提示銀杏內酯B對心肌缺血再灌注性心律失常具有一定的保護作用。

心肌細胞生存與做功均依賴有氧代謝ATP，因此線粒體中ATPase活性對維持細胞內環境穩定及細胞內 Na+、K+、Ca2+、Mg2+等離子穩定具有重要作用［11]。 心肌缺血缺氧將導致能量代謝障礙，進而引發依賴ATP的Ca2+-Mg2+-ATPase活力降低；而Ca2+-Mg2+-ATPase是將Ca2+泵出細胞外的主要途徑，其活力下降將致胞內Ca2+超載而引發心律失常［12-13]。氧自由基損傷是心臟組織缺血再灌注損傷的重要病理機制之一［14]，而氧自由基的損傷及能量耗竭，使Na+-K+-ATPase活力進一步降低，使細胞外K+增多，且呈現自缺血中央區至邊緣區K+含量逐漸下降的不均勻分布態勢［15-16]，而局部K+分布不均勻可促進心律失常的發生。本研究發現，經銀杏內酯B 30～60 mg/kg預處理能夠改善Ca2+-Mg2+-ATPase、Na+-K+-ATPase活力并降低Ca2+含量，改善抗氧化酶（SOD、GSH-Px）活性并降低MDA含量，這可能是銀杏內酯B抑制心肌缺血再灌注性心律失常的重要分子機制之一。

綜上所述，銀杏內酯B對大鼠心肌缺血再灌注性心律失常具有一定的保護作用，其機制可能與改善Ca2+-Mg2+-ATPase、Na+-K+-ATPase 活力并降低 Ca2+含量以及抑制氧自由基損傷有關。

［1]付曉春，陳建軍，王艦平.黃連解毒湯對心肌缺血再灌注心律失常的保護作用［J].實用醫學雜志，2012，28（23）：3874-3876.

［2]熊年，韋晟.銀杏內酯B對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究［J].中國現代應用藥學，2015，32（3）：289-294.

［3]白志超，陳名超，李鶴飛.銀杏內酯B對心肌缺血再灌注損傷大鼠氧化應激反應的影響［J].中國中醫急癥，2016，25（8）：1480-1483.

［4]郝艷玲，楊艷，吳金霞，等.銀杏內酯B后處理改善缺血/再灌注損傷的老年大鼠心功能［J].中國新藥雜志，2016，25（23）：2707-2713.

［5]睢大員，于小風，曲紹春，等.刺五加葉皂苷對大鼠心肌缺血再灌注心律失常的影響［J].吉林大學學報：醫學版，2004，30（4）：530-533.

［6]李冀，趙偉國，李勝志，等.桂枝甘草湯提取物組分對大鼠心肌缺血再灌注心律失常的影響［J].時珍國醫國藥，2009，20（8）：2052-2054.

［7]李濤，袁春桃.丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷大鼠心肌組織和心律失常的保護作用［J].中國老年學雜志，2017，37（13）：3154-3156.

［8]王彥，趙英男，鄒麗琳，等.心肌缺血-再灌注損傷大鼠心電圖變化機制的研究［J].大連醫科大學學報，2010，32（2）：160-165.

［9]沈永照，劉秀紅，杜亞軍，等.老年急性心肌梗死后發生嚴重心律失常的臨床影響因素分析［J].海南醫學，2015，26（23）：3468-3470.

［10]汪覆鳴，秦宏，冷麗佳，等.利多卡因和維拉帕米對心肌缺血-再灌注性心律失常及血流動力學的干預作用［J].第四軍醫大學學報，2009，30（10）：916-919.

［11]李冀，趙偉國，李勝志，等.桂枝甘草湯提取物組分對大鼠心肌缺血再灌注心律失常的影響［J].時珍國醫國藥，2009，20（8）：2052-2054.

［12]李濤，袁春桃.丹參酮ⅡA對缺血再灌注損傷大鼠心肌組織和心律失常的保護作用［J].中國老年學雜志，2017，37（13）：3154-3156.

［13]張萍，王海云，蘇博，等.延胡索提取物對AMI大鼠模型心肌梗死面積及 Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性的影響［J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15（4）：410-415.

［14]張衛萍，鄧楊陽，任建勛，等.淫羊藿總黃酮對大鼠心肌急性缺血再灌注損傷氧化應激干預機制的研究［J].中國中藥雜志，2016，41（18）：3400-3405.

［15]Coronel R，Fiolet JM，Wilma Schopoman FJ.Distribution of extracelluar potassium and its relation to electrophy siologic changes during acutemyocardia lischemiain theisolate dperfused porcineheart［J].Circulation，1998，77：1125-1132.

［16]馮旭光.大鼠心肌缺血再灌注損傷中氧自由基、心肌細胞凋亡和缺血再灌注性心律失常的相關性［J].中西醫結合心血管病雜志，2016，4（30）：73-76.