耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測與分子流行病學研究*

楊 雪，劉 琳，趙 丹，張湘燕△

(1.貴州醫科大學，貴陽 550000；2.貴州省人民醫院，貴陽 550000)

肺炎克雷伯菌是臨床最常見的條件致病菌之一，可引起肺炎、尿路感染、敗血癥、傷口感染、腦膜炎等[1]。近年來隨著抗菌藥物的廣泛應用，尤其是第3代頭孢菌素及碳青霉烯類的不合理使用，導致細菌出現嚴重的耐藥性。2015年我國耐藥細菌監測網提供的數據顯示，全國肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類的耐藥率為7.6%，各省為0.5%～20.0%，均較2014年有所增加[2]。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenemresistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)的感染增加了臨床治療的難度和患者預后風險。本研究收集37株CRKP菌株，檢測相關耐藥基因，采用多位點序列分型(MLST)對其進行分子流行病學研究，以揭示其耐藥克隆的特征，以期為防治CRKP的傳播提供參考依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 隨機選取2016年2月至2017年2月貴州省人民醫院臨床分離到的CRKP，排除同一患者重復菌株，共37株。標本來源包括痰液、血液、中段尿、腹腔積液等。菌株經美國BD公司Phoenixtm-100全自動微生物分析系統檢測。

1.1.2主要試劑 藥敏紙片及M-H平板均購自英國Oxoid公司，0.5 mol/L的EDTA溶液為本室所有；2×Taq Master Mix和離心柱型細菌基因組 DNA 提取試劑盒均購自北京康維世紀有限公司。所有引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.1.3主要儀器 全自動微生物鑒定儀購自美國BD公司，PCR擴增儀購自美國ABI公司，電泳儀購自北京六一儀器廠，凝膠成像儀購自美國Alpha Innotech公司。

1.2方法

1.2.1細菌鑒定、藥敏試驗及表型確證 采用Phoenixtm-100全自動微生物分析系統進行細菌鑒定，用微量肉湯稀釋法測定13種抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)，結果判定按美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)2015年版標準執行；質控菌株：大腸埃希菌ATCC 25922及K.pneumoniae標準菌株ATCC700603均購自衛生部臨床檢驗中心。碳青霉烯類檢測參照CLSI介紹使用改良霍奇實驗。金屬β-內酰胺酶檢測采用亞胺培南+EDTA復合紙片的雙紙片協同法。

1.2.2耐藥基因檢測 PCR法檢測A類(KPC-2、GES)、B類(IMP、VIM、NDM-1)和D類OXA-48耐藥基因。參照GeneBank中目的基因的標準序列及相關文獻設計引物[3-4]。PCR反應體系為50 μL，包括2×Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，滅菌蒸餾水19 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性1 min，退火溫度1 min，72 ℃延伸1 min，38個循環；最后72 ℃延伸10 min，見表1。擴增的產物經1.5%的瓊脂糖凝膠中經110 V電泳1 h后，用凝膠成像系統觀察結果并拍照分析。PCR產物經上海生工生物工程公司完成測序，結果用 BLAST軟件與Genbank上已公布的基因序列進行比對。

表1 耐藥基因引物擴增序列及退火溫度

1.2.3MLST實驗 根據MLST網站(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.h-tml)提供的引物序列，擴增肺炎克雷伯菌的7個管家基因，包括gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB及tonB，引物序列及退火溫度見表2。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后拍照并送至上海生工生物工程公司測序。將測序所得到的結果在肺炎克雷伯菌MLST數據庫官方網站 (https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_mlst_seqdef&set_id=13&page=sequ-enceQuery)中進行BLAST比對，得到每個管家基因的等位基因編號，和數據庫中已有序列不能完全比對的，經再次PCR及測序后確認為新的等位基因型，將序列及測序文件遞交至數據庫以獲得新的命名。將7個管家基因所得到的編號按照gapA-infB-mdh-pgi-phoE-rpoB-tonB組合，與MLST數據庫中已有管家基因譜進行比對，得到每株細菌對應的ST型。

1.2.4MEGA軟件構建進化樹、eBURST軟件分析親緣關系 將本研究獲得的等位基因序列數據及ST信息使用MEGA軟件構建進化樹、eBURST軟件進行親緣關系分析。

1.2.5臨床資料的分析 對37株細菌的臨床資料進行收集整理，包括感染者性別、年齡、基礎疾病、感染途徑、住院病房、侵入性操作、感染CRKP前抗菌藥物使用情況、預后情況、住院時間等，將其分成ST11型組及非ST11型組。

1.3統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行分析。年齡、住院時間的組間比較采用t檢驗，其他項目的組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

表2 管家基因引物擴增序列及退火溫度

2 結 果

2.1藥敏結果 37株CRKP對13種藥物呈現不同程度的耐藥，對碳青霉烯類藥物(亞胺培南、美羅培南)呈現不同程度耐藥，4～256 μg/mL。對氨基糖苷類的慶大霉素、第3代頭孢菌素頭孢曲松及臨床上常用的抗菌藥物聯合β-內酰胺酶抑制劑(阿莫西林/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦)均出現高水平耐藥，較為特別的是，哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率為91.9%，32～256 μg/mL。而對阿米卡星耐藥率稍低，為89.2%，1～256 μg/mL；對于阿奇霉素、左氧氟沙星、頭孢西丁、頭孢他啶耐藥率均為97.3%。

2.2改良霍奇實驗及金屬酶檢測結果 改良霍奇實驗顯示37株菌株均為陽性，陽性率100%，金屬酶檢測結果有3株陽性，陽性率為8.1%。

2.3耐藥基因檢測 PCR檢測結果顯示，37株菌株均含有KPC-2基因，檢出率最高，有3株同時含有NDM-1基因，均未檢出OXA-48、GES、IMP、VIM基因。所有陽性基因均經測序，BLAST軟件與Genbank上已公布的基因序列進行比對，同源性均大于或等于99.0%，見圖1、2。

M：Marker600D；+：陽性對照；-：陰性對照；1～5：菌株編號

圖1 KPC-2基因擴增產物電泳圖

M：Marker600D；+：陽性對照；-：陰性對照；6、26、27：菌株編號

圖2 NDM-1基因擴增產物電泳圖

2.4MLST及分子遺傳學結果分析 37株菌株經7個管家基因的PCR結果測序比對，可分為8個ST型，以ST11 25株為主，其次為ST789 4株、ST524 2株，ST35、ST29、ST1066及ST244各1株。有1個新的ST型已被PubMlst數據庫確認收錄并命名為ST2792(2株)，見圖3、4。

2.5臨床資料分析 通過比較發現，ST11型組及非ST11型組在年齡、性別、感染途徑、抗菌藥物使用情況及住院時間等差異無統計學意義(P<0.05)。但總體而言，感染者年齡大、住院時間長、基礎疾病多、入院后有較多的侵入性操作、使用多種抗菌藥物治療都是CRKP感染的潛在原因。

圖中每一個點代表一個ST，藍色代表各自克隆復合體的祖先，黃色代表各自克隆復合體亞群的原始型，標有紅色圓圈切帶有數字的點表示本次研究中所得到的ST型，其他黑色的點表示本次試驗外數據庫中的ST

圖3 eBURST軟件分析結果

圖4 META分析構建37株菌株進化

3 討 論

產生碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要原因[5]。目前，碳青霉烯酶包括Ambler分類中的A、B、D類。A類主要水解除頭霉素類以外的幾乎所有β-內酰胺類抗菌藥物，包括KPC、GES等；B類能水解青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類抗菌藥物，但不能水解氨曲南，主要包括IMP、VIM、NDM-1等；D類為苯唑西林水解酶，主要為OXA-48。本研究中37株菌株改良霍奇實驗均為陽性，且經測序發現全部攜帶KPC-2基因，僅有3株同時攜帶NDM-1基因，未發現GES、IMP、VIM、OXA-48基因，說明KPC-2是CRKP對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥最主要的原因，與國內外研究一致[6-8]。攜帶KPC-2基因的CRKP菌株對本研究中的13種抗菌藥物均呈現了高水平耐藥，耐藥率基本達到90%以上，多耐藥、高水平耐藥情況嚴重；而同時攜帶KPC-2和NDM-1的菌株對包括氨曲南在內的13種抗生素全部耐藥，但其耐藥水平并未高于只攜帶KPC-2基因的耐藥菌株，說明同時攜帶多種碳青霉烯酶基因可以擴大耐藥范圍，但并不一定提高耐藥水平。目前已有研究證實，KPC-2編碼的基因位于T4401的轉座子上[9]，毛彩萍等[10]在KPC-2基因陽性的菌株中檢測到插入序列ISKpn6，且這兩個基因連鎖排列；這導致KPC-2基因可以通過轉座子、插入序列等方式在不同菌株間傳播[11]，造成爆發流行。

本研究中37株菌株主要來源于重癥監護室ICU(24.3%)、神經內科ICU(27.0%)、呼吸內科ICU(8.1%)、神經外科(10.8%)等；標本類型主要為痰(73%)和尿(11%)，可能與患者基礎疾病重，住院時間長，使用多種抗菌藥物及進行侵入性操作有關[12]。利用MLST對37株菌株進行分型及建立進化樹，得到包括ST11(25株)、ST524(2株)、ST35(1株)、ST1066(1株)、ST29(1株)、ST244(1株)、ST789(4株)及新發現的ST2792(2株)在內的8種ST型，其中ST11是最流行的克隆型，這也是我國CRKP最主要的ST型別[13]。本研究新發現的ST2792與最流行的ST11有高度的親緣關系，僅有1個管家基因(infB)發生了變異，其攜帶的耐藥基因也與ST11一致，且耐藥性也無明顯差別。將ST11型與非ST11型菌株的臨床資料進行了對比發現，兩組在年齡、基礎疾病、使用抗生素種類及住院時間等方面差異無統計學意義(P>0.05)，說明ST11型并沒有感染CRKP的特有風險。這與DHAR等[14]的研究結果相似，可能由于這些ST型基本上同屬一個克隆群，少數位點的變異并不會給臨床感染帶來特殊風險。

綜上所述，本研究耐藥基因檢測發現KPC-2基因為最流行的耐藥基因，同時含有NDM-1的菌株，也應引起重視。MLST結果顯示ST11型為最流行的克隆型，新發現的ST2972與其為同一克隆系。在同一區域不同時間可能存在相同基因型或克隆群的CRKP的流行，臨床及相關檢驗科室需加強監測，避免耐藥菌株的播散。然而，本研究未對其他耐藥機制進行檢測，可能存在一定的局限性，因此還有待進一步研究和更多實驗結果的支持。

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