IL-1β、IL-6及下游IDO激活與大鼠抑郁行為的關系研究*

伏簫燕，李海燕，崔 婷，蔣青松，邱紅梅

(重慶醫科大學藥理學教研室/重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室 400016)

抑郁癥是一種以情緒低落、興趣缺失為主要表現的常見精神障礙性疾病，具有不易察覺，病程長，嚴重者導致自殺等特征。抑郁癥發病機制復雜，涉及多種病理生理學改變。近年來研究發現，免疫激活及下游吲哚胺2,3雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)通路激活與抑郁癥發生密切相關[1-2]。眾所周知，機體在免疫激活狀態下，免疫細胞如單核-巨噬細胞、T淋巴細胞等可釋放多種細胞因子，如白介素、腫瘤壞死因子等與相應受體結合調控免疫應答。白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是重要的促炎性細胞因子，在免疫反應和炎癥的啟動和維持中發揮十分重要的作用，是炎性反應系統被激活的直接標志。國內外研究顯示抑郁患者血清IL-1β、IL-6等促炎性細胞因子均顯著升高，提示細胞因子合成、釋放增多參與了臨床抑郁癥的發生[3]。腦內5-羥色胺(serotonin，5-HT)功能不足是公認的抑郁癥發病機制之一，也是臨床治療藥物的重要靶點。色氨酸作為腦內合成5-HT的前體物質，是機體所需的必需氨基酸之一，主要通過色氨酸-5-HT通路和色氨酸-犬尿氨酸通路進行代謝。新的5-HT學說認為，神經炎癥因子增多，誘導色氨酸主要沿色氨酸-犬尿氨酸代謝，而使5-HT合成減少是抑郁癥發病的機制之一。IDO是一種色氨酸降解酶，是肝臟以外唯一可催化色氨酸沿色氨酸-犬尿氨酸途徑代謝的第一限速酶[4]。IDO在生理狀態下低水平表達，但在促炎癥細胞因子如IL-1、TNF等釋放增多及免疫激活時可誘導其表達顯著升高，催化色氨酸沿色氨酸-犬尿氨酸通路代謝，繼而導致色氨酸耗竭和5-HT合成減少，誘發或加重抑郁癥[5-7]。最新臨床和基礎研究結果均顯示炎癥因子釋放增多、IDO過表達與抑郁癥的發生密切相關。目前，臨床研究主要集中于對患者血清或腦脊液，基礎研究主要采用腦內注射脂多糖或β-淀粉樣蛋白等誘導動物抑郁行為并研究腦內炎癥因子及IDO表達變化，尚未見采用慢性不可預見刺激(CUS)誘導動物抑郁癥并研究腦內皮層和海馬炎癥因子及IDO表達異常的報道。

研究已證實社會壓力、環境變化等慢性刺激是誘發抑郁癥的重要因素之一。CUS可模擬人所處的各種社會環境變化，是誘導建立動物抑郁癥的常用模型之一。本研究采用孤養結合CUS建立大鼠抑郁模型，采用Western blot和PCR研究抑郁大鼠大腦皮層及海馬IL-1β、 IL-6及IDO表達與動物抑郁行為的關系，進一步探索抑郁癥的發病機制，尋找新的藥物治療靶點。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 重慶醫科大學動物中心提供清潔級雄性SD大鼠30只，體質量(200±20)g，5只/籠，自由攝食飲水，室溫(23±3)℃，醫學動物許可證號：SYXK(渝)2012-0001。

1.1.2儀器與試劑 熒光定量PCR儀、凝膠成像系統、垂直電泳儀(美國Bio-rad公司)；Trizol、逆轉錄試劑盒、SYBR Green Supermix、PCR引物(日本Takara生物技術公司設計合成)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液(江蘇碧云天生物技術公司)；anti IL-1β、anti IL-6(美國Affinity公司)；anti-IDO(美國Abcam公司)；其余各試劑均為國產分析純。

1.2方法

1.2.1分組及建模 大鼠適應性喂養1周后,采用開場實驗進行行為學測試，將得分相似的大鼠分為對照組(CG組)和模型組(MG組)。CG組大鼠5只/籠，自由攝食飲水，不予刺激。MG組大鼠采用孤養(1只/籠)結合CUS誘導建立大鼠抑郁癥模型。根據本實驗室前期造模方法并稍加修改，采用的刺激方式包括空籠+禁食、噪音3 h、閃頻3 h、熱水浴5 min(45 ℃)、冰水浴5 min(4 ℃)、通宵照明、潮濕墊料24 h、傾斜24 h、夾尾1 min、禁飲禁食24 h、電擊5 min、晝夜顛倒、水平振蕩10 min，每天隨機給予一種刺激，4 d內不出現同種刺激方式。

1.2.2開場實驗 使用規格為100 cm×100 cm×40 cm內部涂為黑色的木質敞箱，箱底部使用白色膠帶均分成20 cm×20 cm的正方形格子。在昏暗安靜的環境中，將大鼠至于中央格，四爪著地后開始計時，記錄大鼠5 min內穿越格子數(四爪進入視為1次)、水平站立數、整理次數及大小便次數，相加得開場實驗得分。

1.2.3強迫游泳實驗 在安靜的環境中，將被測試大鼠放入高60 cm、直徑20 cm、水深30 cm的透明圓柱形玻璃桶中，水溫(23±3)℃，經過2 min的適應期后，記錄后5 min內的累積不動時間。

1.2.4取材 在實驗第29天以4%水合氯醛(1 mL/100 g)麻醉后斷頭取腦，于冰上分離前腦皮層和海馬并置于凍存管中，立即放入液氮中短期保存，后放置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.5qRT-PCR法測定海馬和皮層的IDO mRNA的表達 分別取海馬和皮層40～100 mg，使用通過DEPC水浸泡過的勻漿器研磨(注意該過程使用的槍頭鑷子等均高壓滅酶)，用Trizol提取樣本總RNA，并測定總RNA濃度，以1 μg/20 μL為反應體系進行逆轉錄，同時參照Genbank中大鼠的基因序列(由Takara公司設計合成)。IDO：上游引物5′-GAC ACC TTT TTC CAC GTT CTT C-3′，下游引物5′-TCA CCA ACG TCA TGC TTT ATT C-3′，長度185 bp；β-actin：上游引物5′-GCA GGA GTA CGA TGA GTC CG-3′，下游引物5′-CCT GAC AAT GAC TCG ACG CA-3′，長度74 bp。利用SYBR Green熒光技術在Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀上進行擴增，條件如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s；40個循環。以β-actin為內參，反應結果以Ct值表示，以2-△△Ct計算目的基因的相對表達量。

1.2.6Western blot法檢測IL-1β、IL-6及IDO蛋白的表達 海馬和皮層分別稱取40～100 mg，在冰上加入裂解液后研磨，提取總蛋白，并用BCA法測定總蛋白濃度，按總體積的4∶1的比例加入上樣緩沖液沸水煮10 min。每孔上樣30 μg，按順序采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、PVDF轉膜，5%脫脂牛奶封閉2.5 h，加入對應的一抗(以β-actin為內參)4 ℃孵育過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶3 000稀釋)，洗膜后用發光液(Advanstor 公司)顯色，凝膠成像儀成像后，用Image Lab軟件(Bio-Rad)分析結果。

1.3統計學處理 應用Graph Pad Prism 5.0統計軟件對數據進行分析整理及作圖，組間采用兩獨立樣本t檢驗比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1孤養結合CUS對大鼠行為學的影響 MG組大鼠與CG組相比，其開場實驗得分顯著降低(P<0.01)；與CG組大鼠相比，MG組大鼠不動時間顯著延長(P<0.01)，見圖1。孤養結合CUS成功誘導大鼠產生焦慮、絕望樣抑郁行為，模型建立成功。

A：對開場實驗得分的影響；B：對強迫游泳實驗不動時間的影響

圖1孤養結合CUS對大鼠行為學測試的影響

2.2孤養結合CUS對大鼠皮層和海馬IL-1β、IL-6蛋白表達的影響 與CG組相比，MG組大鼠皮層和海馬IL-1β、IL-6蛋白表達均明顯增高(P<0.05)，見圖2。

A：大鼠皮層IL-1β蛋白表達變化；B：大鼠海馬IL-1β蛋白表達變化；C：大鼠皮層IL-6蛋白表達變化；D：大鼠海馬IL-6蛋白表達變化

圖2 Western blot法檢測抑郁大鼠腦內IL-1β、IL-6蛋白表達變化

2.3孤養結合CUS對大鼠皮層和海馬IDO mRNA及蛋白表達的影響 與CG組相比，MG組大鼠皮層和海馬IDO mRNA及蛋白表達均明顯增高(P<0.01)，見圖3。

A：大鼠皮層IDO mRNA表達變化；B：大鼠海馬IDO mRNA表達變化；C：大鼠皮層IDO蛋白表達變化；D：大鼠海馬IDO蛋白表達變化

圖3 qRT-PCR法及Western blot檢測大鼠腦內IDO mRNA及蛋白表達變化

3 討 論

抑郁癥發病機制復雜，涉及社會、遺傳、環境等眾多因素。目前，國內外抑郁癥的臨床治療和研究方向均主要集中在單胺遞質系統功能的調節，但該類藥物治療無效率高達30%～40%，且治療后也可能出現抑郁癥狀持續存在及復發的風險[8-9]，給家庭及社會造成巨大的經濟壓力和社會負擔。因此，進一步探索抑郁癥發病機制，尋找藥物防治新靶點具有十分重要的現實意義。本研究采用CUS建立大鼠抑郁模型[10]，該模型可模擬抑郁患者在社會環境中接受的多種慢性刺激，是常用的慢性抑郁癥模型之一。在行為學指標測定中，開場實驗和被動游泳是評價大鼠抑郁行為的常用指標。結果顯示，與CG組相比，MG組大鼠開場試驗得分顯著降低，提示其對新異環境的探究行為顯著下降；MG組大鼠被動游泳實驗中不動時間顯著延長，提示其出現顯著焦慮、絕望樣抑郁行為改變，模型建立成功。

應激作為抑郁癥發生的常見危險因素，可通過激活免疫系統及炎癥反應，促進細胞因子釋放而參與臨床抑郁癥的發生[11]。“抑郁癥的細胞因子學說”指出，抑郁癥的發生可能與炎癥細胞因子釋放及IDO激活等因素相關。細胞因子是一類主要由活化的免疫細胞合成和釋放的可參與免疫反應、細胞生長、組織損傷修復等的可溶性小分子蛋白質。細胞因子在體內形成復雜的細胞因子調節網絡，通過旁分泌、自分泌或內分泌等方式發揮相應的生理或病理作用。在多種神經系統疾病中均發現有炎癥細胞因子的合成和釋放增多，包括IL-1β、IL-6等。近年來研究發現，這些炎癥細胞因子可能通過影響神經-免疫-內分泌調節和5-HT代謝障礙參與抑郁癥的發生、發展，但尚缺乏系統研究[12-13]。目前，大量研究均發現抑郁癥患者血清及腦脊液IL-1β、IL-6等炎癥因子顯著升高[14-18]，提示這些細胞因子的激活可能參與了抑郁癥的發生，但缺乏大腦實質內細胞因子變化的相關研究資料。研究結果顯示，與CG組相比，MG組大鼠大腦皮層及海馬IL-1β、 IL-6蛋白表達顯著增加，提示大鼠抑郁行為與腦內炎癥因子表達增高密切相關，并與前述臨床研究結果相互印證。IDO是一種細胞內的含亞鐵血紅素的酶，是催化色氨酸沿犬尿氨酸通路代謝的限速酶。多種炎癥細胞因子可通過過度激活IDO，誘導色氨酸主要沿犬尿氨酸途徑代謝，引起色氨酸耗竭并繼發5-HT合成不足，同時該途徑產生的3-羥犬尿氨酸、喹啉酸等神經毒性產物也可能參與了抑郁癥的發生。本研究結果顯示，與CG組相比，MG組大鼠海馬和皮層IDO mRNA及蛋白表達均顯著升高，提示腦內出現IDO過度激活，繼而可能導致色氨酸-犬尿氨酸代謝途徑的過度激活，造成色氨酸耗竭和5-HT合成不足，參與抑郁癥的發病。

綜上所述，孤養結合CUS誘導大鼠抑郁行為可能與腦內炎癥因子表達增高并誘導IDO過表達密切相關，在下一步實驗中筆者將采用IDO拮抗劑及炎癥因子拮抗劑來驗證這一推測。

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