兩種方法建立SD大鼠黃褐斑模型的比較實驗研究*

鄧志博，何施逸，王乾力，李韞韜，胡喬莉，杜永洪

(重慶醫科大學生物醫學工程學院省部共建國家重點實驗室培育基地-重慶市超聲醫學工程重點實驗室/重慶市生物醫學工程學重點實驗室，重慶 400016)

黃褐斑的形成主要是因為黑色素細胞的活性及功能增強和黑色素顆粒的明顯增多[1]，其中以基底層和棘層最為明顯。黑色素細胞活性增強的原因尚不清楚，推測與內分泌的失調、紫外線輻照、氧自由基、遺傳因素、子宮卵巢疾病、血清酮含量及情緒等有關[2-3]。無療效確切的中西醫治療方案[3-5]。目前，黃褐斑動物建模的方法有雌激素全身攻擊法、紫外線照射法和微量定點注射輔以紫外線照射法、黃體酮+紫外線+慢性應激抑郁法等[6-7]。本文根據致黃褐斑的內分泌失調與紫外線照射兩個假說，比較分析肌內注射黃體酮和紫外線照射兩種方法建立SD大鼠黃褐斑模型的優缺點。

1 材料與方法

1.1實驗動物 28只SD大鼠，雌性，體質量(270±30)g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，SPF級。

1.2儀器與試劑 窄譜311紫外線燈(深圳市可立士光電設備廠，型號：CLS-UV)；黃體酮注射液(1 mL∶20 mg，天津金耀藥業有限公司，國藥準字：H120233)；總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(WST-1法，96T,南京建成生物工程研究所，生產批號：20160630)；丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA法,96T，南京建成生物工程研究所，生產批號：20160628)。

1.3方法

1.3.1實驗動物分組 將28只雌性SD大鼠分為5組：對照組6只、高劑量黃體酮組6只、低劑量黃體酮組6只、高劑量紫外線組5只、低劑量紫外線組5只。

1.3.2建模 高、低劑量黃體酮組于每日14:00-16:00分別在SD大鼠大腿根部肌內注射黃體酮注射液25 mg/kg、10 mg/kg，兩側大腿左右交替注射，共30 d。對照組注射等量的生理鹽水。高、低劑量紫外線組于每日14：00-15:00分別用311UVB紫外線輻照60、30 min，輻照高度距脫毛后的皮膚表面均為30 cm，輻照面積為20×30 cm2，共14 d。

1.3.3皮膚、肝臟組織勻漿的制備 紫外線組于第15天、黃體酮組于第30天處死大鼠，腹主動脈取血，后取皮膚、肝臟組織用預冷生理鹽水(4 ℃)沖洗干凈，于實驗室配制成濃度為5%的組織勻漿待測。

1.3.4皮膚斑塊形成的計算 采用網格肉眼計數估算。網格大小為每格1 mm，中間去掉，只余網線，將大鼠麻醉去毛后置于大鼠背部皮膚計數，每組取平均值。

1.3.5檢測組織勻漿中SOD、MDA水平 將不同組織上清液稀釋成相應的濃度后按測試盒說明書要求操作。

1.3.6檢測皮膚病理黑色素顆粒沉著 取大鼠病變皮膚固定，常規石蠟包埋切片，HE染色，光學顯微鏡觀察。

2 結 果

2.1不同時間肉眼觀察病變大小情況 在建模第7天高、低劑量紫外線組SD大鼠背部皮膚已經基本可以看見色素斑塊形成，且高劑量組比低劑量組明顯，但黃體酮組變化并不明顯。在建模的第14天高劑量黃體酮組已經基本可以看見少量的色素沉積，但低劑量組幾乎無變化，高、低劑量紫外線組色素沉著明顯但差異無統計學意義(P>0.05)。建模組與未建模組在第28天肉眼可見明顯區別，見圖1、2。

圖1 不同時間斑塊面積變化趨勢

A:未建模組第28天；B:高劑量黃體酮組建模第28天；C:低劑量紫外線組建模第14天；D:高劑量紫外線組建模第14天

圖2各組大鼠皮膚變化情況

2.2血清、肝臟組織、皮膚組織中SOD及MDA水平 與對照組比較，高劑量黃體酮組大鼠MDA水平升高、SOD水平降低，低劑量黃體酮組大鼠血清與皮膚組織中的SOD水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。高劑量紫外線組大鼠血清和皮膚組織中的SOD水平降低、MDA水平升高，低劑量組紫外線的大鼠皮膚組織中的SOD水平降低(P<0.05)，但兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠皮膚組織、肝臟組織、血清中SOD及MDA水平變化

圖3 高劑量黃體酮組HE染色(×100)

圖4 低劑量黃體酮組HE染色(×100)

2.3皮膚病理學變化觀察 光學顯微鏡下，對照組偶見少量黑色素顆粒沉著，建模組可見黑色素顆粒顯著成團堆積形成黑素小體。其中高劑量黃體酮組個體間黑色素顆粒沉著雜亂，多數呈層狀密集排列，偶見少量色素呈單線型排列，見圖3；低劑量黃體酮藥物組大多呈單線型散在分布，見圖4；高、低劑量紫外線組無明顯的差異，呈線性排列，見圖5、6。

圖5 高劑量紫外線組HE染色(×100)

圖6 低劑量紫外線組HE染色(×100)

3 討 論

根據黃褐斑的發生與內分泌有關及目前學術界流行的“雌激素和黃體酮增多進而刺激黑色素細胞而致色素沉著”的學說[8]，采用肌內注射黃體酮(孕激素)的方法使大鼠的內分泌失調，間接的測量SOD和MDA來反映機體的氧化/抗氧化平衡[9]。本研究采用25 mg/kg和10 mg/kg的黃體酮肌內注射大鼠，高劑量黃體酮組大鼠MDA水平升高、SOD水平降低，低劑量黃體酮組大鼠血清與皮膚組織中的SOD水平降低。肌內注射藥物作為一種全身用藥，其不穩定性太大，個體差異較大，不可控因素太多。其次，判斷黃褐斑形成的最直接、最客觀的辦法是皮膚病理組織檢查黑色素顆粒的沉著，其多位于表皮的基底層與棘層。高劑量黃體酮組的大鼠皮膚病理組織可見位于基底層和棘層的層狀密集排列的黑色素顆粒形成黑素小體，而低劑量黃體酮組的黑色素顆粒大多則是散在分布。由此可知，肌內注射高、低劑量的黃體酮建立黃褐斑大鼠模型在生物化學、病理學指標方面都有差異。

第二屆理療和光生物學大會提出[10-11]，UVB是光譜為275～320 nm的紫外線，其生物效應十分活躍，于紫外線下20～30 min可使皮膚曬傷變紅，長期暴露局部皮膚，色素沉著明顯,加速皮膚老化過程[12]。中波紫外線使黑素細胞增多進而黑色素生成增多[13]，作為一種外源性刺激作用于大鼠，黑色素顆粒增加，并形成黑色素小體，從而形成黃褐斑[12]。本實驗用中波紫外線刺激從而建立黃褐斑大鼠模型，設置了高低劑量兩個組，分別輻照30 min和60 min，結果顯示高低劑量組之間無明顯差異，建模第14天后大鼠背部皮膚均可見色素沉著，血清、肝臟組織、皮膚組織的SOD水平降低(P<0.05)，MDA升高(P<0.05)，變化幅度無明顯差異，大鼠皮膚病理組織檢查均可見位于基底層和棘層的單線型密集排列的黑色素顆粒。

綜上所述，中波紫外線相對于黃體酮建模而言具有快速、高效、個體差異小、操作簡單等優點。

[1]CAYCE K A,MCMICHAEL A J,FELDMAN S R.Hyperpigmentation:an overview of the common afflictions[J].Dermatol Nurs，2004,16(16):401-406,413-417.

[2]MOIN A,JABERY Z,FALLAH N.Prevalence and awareness of melasma during pregnancy[J].Int J Dermatol,2006,45(3):285-288.

[3]湯楠,吳艷華,李其林,等.黃褐斑病因及發病機制研究現狀[J].皮膚性病診療學雜志,2013，20(4):302-304.

[4]張國棟,周霈,黃亦琦.黃褐斑發病機制及治療[J].福建醫藥雜志,2015，37(1):128-130.

[5]李娟,顏敏,張媛,等.黃褐斑病因、發病機制及治療進展[J].中國麻風皮膚病雜志,2016,32(2):123-126.

[6]張海燕,王軍.黃褐斑實驗動物模型的應用研究概況[J].中國民族民間醫藥,2009,18(8):41-42.

[7]楊鵬,楊慧蘭,麥躍,等.慢性應激抑郁型黃褐斑動物模型建立與現有模型的比較研究[J].中國美容醫學雜志,2013,22(3):349-354.

[8]GRIMES P E,YAMADA N,BHAWAN J.Light microscopic,immunohistochemical,and ultrastructural alterations in patients with melasma[J].Am J Dermatopathol,2005,27(2):96-101.

[9]過偉峰,徐立,項曉人,等.建立小鼠黃褐斑實驗動物模型的初步研究[J].中國中醫基礎醫學雜志,2001,7(2):49-51.

[10]FOLBERG R,BARON J,REEVES R D,et al.Animal model of conjunctival primary acquired melanosis[J].Ophthalmology,1989,96(7):1006.

[11]陳庭仁.紫外線治療學[M].重慶：科學技術出版社重慶分社,1986:61.

[12]張琳西,王臻,郭樹忠,等.中波紫外線對體外培養的人黑色素細胞的影響[J].中國美容醫學,2001,10(3):180-182.

[13]KANG H Y,HWANG J S,LEE J Y,et al.The dermal stem cell factor and c-kit are overexpressed in melasma[J].Brit J Dermatol,2006,154(6):1094-1099.