阿魏酸聯合脂肪間充質干細胞調節TGF-β/Smad信號轉導通路對肝星狀細胞凋亡的影響研究*

許希燕，王巧稚，羅 茂，余 鴻，劉廣益△

(西南醫科大學：1.基礎醫學院；2.藥物研究中心，四川瀘州 646000)

肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內細胞外基質 (extracellular matrix,ECM)過度沉淀的一個病理過程，是肝臟對各種慢性損傷產生的一種修復反應，是多種肝病的必經階段。肝纖維化的核心機制是肝星狀細胞(hepatic satellite cells,HSCs)的活化[1-2]，所以治療肝纖維化的關鍵是抑制HSCs增殖或促進其凋亡,從而抑制其分泌ECM或促進ECM降解。而在HSCs活化眾多路徑中，轉化生長因子-β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)是促肝臟纖維發生的最強有力細胞因子。TGF-β1主要通過TGF-β/Smad信號通路在體內進行表達，Smad蛋白介導了TGF-β1的胞內信號轉導[3]。

骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)移植是治療肝纖維化的新方法，除了通過分化為肝細胞對肝臟進行直接修復外，還可經旁分泌途徑誘導HSC凋亡。脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)為間充質干細胞的一種，具有和BMSCs相似的分化傾向和功能[4-6]。阿魏酸(Ferulic acid,FA)屬酚酸類化合物，是中藥川芍、當歸等的主要成分之一，具有抗血小板聚集、抑制炎性反應、抗氧化等作用。有研究證實，FA可有效降低肝硬化患者門靜脈壓力，改善肝纖維化指標[7-9]。本研究探討大鼠ADMSCs和FA通過抑制TGF-β/Smad信號通路對HSCs凋亡的影響，以期為肝纖維化治療提供實驗依據和新思路。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠肝星狀細胞系(HSC-T6，江蘇凱基生物技術股份有限公司)；SD大鼠ADMSCs[賽業(廣州)生物科技有限公司]；阿魏酸鈉(標準品，大連美侖生物技術有限公司)；DMEM/F-12培養基(上海Gibco公司)；胎牛血清(杭州天杭生物科技股份有限公司)；MTT粉劑(北京Solarbio公司)；DMSO(美國Sigma公司)；6孔Transwell培養板(美國Corning公司)；Annexin-V/PI凋亡染色試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)；總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；RNA逆轉錄試劑盒(北京TOYOBO公司)；熒光定量PCR反應試劑盒(德國QIAGEN公司)；兔抗大鼠TGF-β1、Smad2/3、Smad7、p-Smad2/3抗體(美國Santa Cruz公司)；ELISA試劑盒(北京誠林生物公司)； PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將HSCs、 ADMSCs復蘇后，接種于10%FBS含雙抗的DMEM/F-12培養基，置于37 ℃、5%的CO2飽和濕度培養箱中常規培養。

1.2.2實驗分組 取對數生長期的ADMSCs和HSCs，以1∶5的比例分別接種于0.4 μm Tanswell半透膜、6孔板中，用10%FBS DMEM/F-12培養，待兩種細胞密度達到約70%后均換為無血清培養基。將HSCs分為4組：空白組，HSCs單獨培養，不加FA和ADMSCs；FA組，加FA處理HSCs；ADMSCs組加入ADMSCs，用Tanswell建立上下雙層細胞共培養體系；FA+ADMSCs組，在ADMSCs與HSCs共培養體系中加入FA共同作用(實驗前期用MTT法檢測得FA的最適藥物處理濃度為200 μg/mL)；以上4組均用無血清DMEM/F-12培養24 h。

1.2.3流式細胞儀檢測HSCs的凋亡率 收集細胞后用預冷的PBS漂洗2次，加入500 μL Binding Buffer重懸，用5 μL FITC Annexin V和 5 μL PI進行染色，室溫、避光反應15 min后用流式細胞儀檢測各組凋亡率，重復3次。凋亡率=早期凋亡+晚期凋亡。

1.2.4RT-PCR檢測HSCs的TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA表達 收集細胞，用Trizol提取各組細胞總RNA，核酸蛋白儀測定總RNA的濃度及純度。按反轉錄試劑盒說明書操作，逆轉錄反應合成cDNA。以反應所得cDNA在Myi Q實時定量PCR儀上進行PCR反應。每個標本設3復孔，并重復實驗3次，根據2-ΔΔCT法計算相對表達量并進行統計，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5Western blot 檢測HSCs的TGF-β1、Smad7蛋白及p-Smad2/3表達 各組細胞培養結束后用 PBS 清洗 3 遍，收集細胞提取蛋白。加入細胞裂解液裂解細胞，取總蛋白5 μg行SDS-PAGE凝膠電泳，經PVDF 膜轉移，加入一抗4 ℃中孵育過夜，TBST 洗膜3次后再加入二抗孵育1 h。顯影拍照，用凝膠圖像處理系統對目標帶進行分析。內參采用β-actin進行目的蛋白TGF-β1、p-Smad2/3和Smad7的表達分析。

2 結 果

2.1各組HSCs凋亡率 與空白組(7.46±1.26)%比較，ADMSCs組中HSCs凋亡率(9.84±1.64)%變化不明顯(P>0.05)，FA組、FA+ADMSCs中HSCs的凋亡率[(16.81±1.57)、(22.22±2.31)%]均明顯升高(P<0.05)。與FA組、ADMSCs組比較，FA+ADMSCs組中HSCs的凋亡率均明顯升高(P<0.05)，見圖1。

2.2各組HSCs的TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA表達 與其他3組比較， FA+ADMSCs組HSCs的TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達明顯下調，Smad7 mRNA表達明顯上調(P<0.05)，見圖2。

2.3各組HSCs的TGF-β1、Smad7蛋白及p-Smad2/3表達 Western blot結果顯示，與其他3組比較，FA+ADMSCs組HSCs的TGF-β1蛋白表達、p-Smad2/3表達明顯下降，Smad7蛋白表達呈明顯升高趨勢(P<0.05)，見圖3。

A:空白組；B:FA組；C:ADMSCs組；D:FA+ADMSCs組

圖1各組HSCs流式細胞儀凋亡散點圖

圖2 各組HSCs的TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA表達

圖3 各組HSCs的TGF-β1、Smad7蛋白及p-Smad2/3表達

3 討 論

HSCs的激活與凋亡在肝纖維化的發生與逆轉中起關鍵作用[1-3]。TGF-β1主要來源于HSCs，在抑制肝細胞再生的同時激活更多的HSCs，參與和促進肝纖維化的發生、發展進程，其主要通過TGF-β/smad信號轉導通路對肝纖維化進行調控[10]。TGF-β1與胞膜表面特異受體結合后，可激活下游的Smads 蛋白信號通路，其中被激活的p-Smad2/3與胞漿的Smad4 結合形成復合體，轉入胞核調節HSCs的基因表達[11-13]。

FA在腎臟和心臟疾病中具有抗纖維化作用，通過減少活性氧(ROS)和抑制脂質過氧化而具有有效的抗氧化活性，能減輕四氯化碳造成的肝纖維化損傷[14]，但是對HSC是否具有促其凋亡的作用，且通過什么路徑調控仍有待探討。本研究顯示，在無血清條件下，FA能促進HSCs的凋亡及在一定程度上降低TGF-β1的表達水平，且明顯抑制HSCs內Smad3 mRNA、p-Smad2/3的表達，Smad7表達水平明顯升高。提示FA促HSCs凋亡、抗肝纖維化的機制在于下調TGF-β1及下游p-Smad2/3表達的同時，Smad7的表達可能以負反饋的方式上調，從而拮抗由Smad3介導TGF-β1信號轉導路徑。

間充質干細胞分泌的多種細胞因子、生長因子可以參與調節細胞的凋亡、增殖、炎癥反應等生理過程,這些活性因子可能通過旁分泌效應抑制HSCs的增殖或誘導其凋亡[6]。已有研究發現，人來源的間充質干細胞通過TGF-β1/Smad2抑制上皮間質轉換，減輕纖維沉積，從而緩解肝纖維化[15]。也有學者報道， BMSCs與HSCs共培養，能明顯降低HSCs的TGF-β1基因及蛋白表達，上調Smad7基因及蛋白水平[16]。在本實驗中，ADMSCs與HSCs以1∶5的比例共培養24 h，HSCs的凋亡率、TGF-β1及各種Smad表達無明顯改變，可能原因在于ADMSCs的細胞數量較少或培養時間較短，不足以抑制TGF-β1/Smad信號轉導通路。但當在共培養組中同時加入FA聯合作用時，HSCs的p-Smad2/3、Smad3 mRNA表達均下調，Smad7表達上調。

有研究證明，FA可通過激活細胞外信號調節激酶1和2(ERK1/2)的表達來抑制HSCs的活化[17]，ERK1/2激活可促進間充質干細胞的增殖[18-19]。這可以解釋將FA加入ADMSCs與HSCs的共培養體系后，HSCs各指標變化明顯。FA或能通過激活ERK1/2而促進ADMSCs增殖，甚至促進AMDSCs的旁分泌作用，進一步增強HSCs內Smad7 mRNA的負反饋性表達增加并抑制下游p-Smad2/3的表達，從而增強了AMDSCs對HSCs的促凋亡作用。這與本研究項目中的前期動物實驗，脂肪干細胞聯合FA移植治療肝纖維化較單一治療效果更好的結果相一致[20]。至于FA是通過影響AMDSCs的何種旁分泌途徑來抑制TGF-β1/Smad信號轉導通路促進對HSCs凋亡的，還需在今后的實驗中進一步探討。本實驗已證實，FA聯合AMDSCs對HSCs凋亡有協同促進作用，提示二者聯合使用可能為臨床上控制或逆轉肝纖維化提供新的治療方向。

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