β-內酰胺/β-內酰胺酶抑制劑對雙歧桿菌和乳酸桿菌敏感性分析*

李 輝， 張 振

(1.華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院新生兒科 430016；2.上海德濟醫院檢驗科，上海 200331)

β-內酰胺類抗生素(β-lactam)是兒科常用治療細菌感染的一類抗生素，包括對不產β-內酰胺酶(β-lactamase)細菌有效的單一β-lactam抗生素和對產β-lactamase細菌有效的β-內酰胺/β-內酰胺酶抑制劑(β-lactam/β-lactamase inhibitors)。兒童腸道正常菌雙歧桿菌和乳酸桿菌為一類不產β-lactamase細菌，理論上β-lactam/β-lactamase inhibitors對雙歧桿菌和乳酸桿菌的作用與單一β-lactam抗生素相同，然而有研究報道β-lactam/β-lactamase inhibitors比單一β-lactam抗生素導致患兒抗生素相關性腹瀉(antibiotic-associated diarrhea,AAD)發病率高很多，而且是導致患兒AAD高發病率的獨立危險因素[1-2]。本研究將兒童腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌對β-lactam/β-lactamase inhibitors藥敏情況進行了分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1培養基 改良的雙歧桿菌培養基BS(在MRS培養基中添加L-半脫氨酸、放線菌酮、硫酸新霉素、硫酸巴龍霉素、氯化鋰、X-Gal等)[3]，乳酸桿菌培養基為莫匹羅星鋰鹽改良的MRS，改良的BS和MRS液體培養基用于雙歧桿菌和乳酸桿菌的分離及純化，MRS固體培養基用于藥敏試驗。

1.1.2質控菌株 雙歧桿菌和乳酸桿菌培養及鑒定質控菌株為鼠李糖乳桿菌ATCC 7469、嬰兒雙歧桿菌ATCC15697，藥敏質控菌株為脆弱擬桿菌ATCC25285、多形擬桿菌ATCC29741，全部質控菌株均購自上海北諾生物科技有限公司。

1.1.3試劑 生化鑒定管(淀粉、蔗糖、果糖、棉籽糖、阿拉伯糖、蜜二糖、纖維二糖、甘露醇、山梨醇、麥芽糖、甘露糖、木糖、乳糖、半乳糖、硫化氫、硝酸鹽還原等)購自杭州濱和微生物試劑有限公司，API-50CH 和API-50CHL厭氧菌鑒定卡購自法國BioMerieux公司，PCR試劑(蛋白酶K、PCR buffer、dNTP、TaKaRa Ex Taq酶、雙歧桿菌和乳酸桿菌擴增引物等)購自美國Invitrogen 公司，E-test 藥敏試劑條(氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林、替卡西林/克拉維酸、頭孢哌酮、頭孢哌酮/舒巴坦)購自法國BioMerieux公司。

1.1.4設備 電熱恒溫培養箱(上海精宏實驗有限公司)； MARKⅡ型厭氧微需氧培養系統(荷蘭ANOXOMAT公司)；電熱恒溫干燥箱(上海一恒科技有限公司)；高壓滅菌鍋(北京醫療儀器有限公司)；GeneAmp PCR System 9700型PCR儀(美國ABI公司)；無菌操作臺、冰箱、離心機等實驗室所需的常用設備。

1.2方法

1.2.1樣品采集與處理 用滅菌棉簽取36例母乳喂養健康嬰幼兒(年齡1個月至1歲)糞便約1 g，快速放入滅菌裝有液態石蠟油和9 mL緩沖蛋白胨水溶液的試管中，充分振蕩搖勻，做成1∶10的均勻稀釋液，用緩沖蛋白胨水溶液作稀釋液，可以有效保護雙歧桿菌和乳酸桿菌的存活，避免受外界環境因素的影響。另取1 mL滅菌移液管吸取上述稀釋液注入滅菌的含有9 mL緩沖蛋白胨水溶液試管中，充分振蕩搖勻，做成1∶100的均勻稀釋液。按上述操作順序，依次做成1×10-7～1×10-3梯度的均勻稀釋液。

1.2.2分離培養 將1×10-5、1×10-6和1×10-73種梯度的糞便稀釋液各取1 mL分別注入無菌平皿中，每個梯度的稀釋液裝2塊平皿，并做空白對照。在加入樣品稀釋液的平皿中，分別注入冷卻至50 ℃左右的選擇性改良BS和MRS培養基適量，然后放入(37±1)℃的MARKⅡ型厭氧培養箱中厭氧培養48～72 h。

1.2.3初步鑒定 分離培養的細菌先采用常規鑒定方法：革蘭染色鏡檢、H2O2試驗、糖發酵試驗、生化試驗等，結合《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第9版)初步鑒定細菌，然后使用法國BioMerieux公司生產的 API-50CH 檢測雙歧桿菌、API-50CHL 檢測乳酸桿菌。

1.2.416SrDNA序列測定 參考文獻[4]方法，采用液氮反復凍融的方法提取初步分離到的雙歧桿菌和乳酸桿菌DNA，將 DNA 原液稀釋到100 ng/μL，雙歧桿菌PCR引物為：上游5′-GAT FCT GGC TCA GGA TGA ACG C-3′，下游5′-CTG ATA GGA CGC GAC CCC AT-3′；乳酸桿菌PCR引物為：上游5′-CTG ATG AAA GCC CTC G-3′，下游：5′-GAG CCT CAG CGT CAG TG-3′。PCR反應體系包括10×buffer 5.0 μL，4×dNTP 1.0 μL，上下游引物(25 mol/L)各0.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)5 μL，Taq酶(5 U/μL)0.4 μL，DNA模板5 μL，蒸餾水32.6 μL，共50.0 μL。使用GeneAmp PCR System9600型PCR儀進行擴增，反應條件：95 ℃預變性5 min后，95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 45 s，共35個循環，最后以72 ℃ 10 min延伸至結束。然后將擴增成功的產物寄往上海美吉生物醫藥有限公司測序，將測序結果上傳到NCBI使用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)完成比對鑒定。

1.2.5藥敏試驗 按照CLSI制定的方法及標準，使用法國BioMerieux公司E-test試紙條檢測氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林、替卡西林/克拉維酸、頭孢哌酮、頭孢哌酮/舒巴坦的MIC值，試紙條的濃度為0.016～256.000 μg/mL。按照瓊脂擴散法將菌液均勻涂布與整個MRS平皿表面，放置15～20 min，等水吸干后，用鑷子將E-test試紙條放置于平皿中央，放37 ℃厭氧培養24 h后觀察結果，孵育后圍繞著試條可形成一個卵圓形的抑菌圈，抑菌圈與試條的橫向相交處的讀數刻度，即是此抗生素的MIC。

1.3統計學處理 采用SPSS19.00統計軟件進行分析。計數資料以百分率(%)表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1雙歧桿菌和乳酸桿菌分離培養結果 從36例母乳喂養健康嬰幼兒糞便中共分離出45株雙歧桿菌和39株乳酸桿菌。

表1 45株雙歧桿菌藥敏結果分析

-：此項無數據

2.2雙歧桿菌藥敏結果 45株雙歧桿菌對氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林、替卡西林/克拉維酸、頭孢哌酮的敏感百分率分別為77.78%、95.56%、88.89%、73.33%、91.11%、68.89%、84.44%、82.22%，除頭孢哌酮/舒巴坦沒有CLSI藥敏MIC解釋標準而無法判斷外，其他β-lactam/β-lactamase inhibitor均較單一β-lactam抗生素敏感百分率升高，氨芐西林與阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林與哌拉西林/他唑巴坦的敏感數P值分別為0.01、0.03，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.3乳酸桿菌藥敏結果 39株乳酸桿菌對上述抗生素的敏感百分率分別為74.36%、94.87%、92.31%、71.79%、92.31%、69.23%、89.74%、79.49%，除頭孢哌酮/舒巴坦沒有CLSI藥敏MIC解釋標準而無法判斷外，其他β-lactam/β-lactamase inhibitor均比單一β-lactam抗生素敏感百分率升高，氨芐西林與阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林與氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林與哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林與替卡西林/克拉維酸的敏感數P值分別為0.01、0.03、0.02、0.03，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 39株乳酸桿菌藥敏結果分析

-：此項無數據

3 討 論

產β-lactamase細菌能夠水解β-lactam類抗生素，從而導致治療失敗，β-lactam/β-lactamase inhibitors是目前兒科治療產β-lactamase細菌感染的主要抗生素之一，主要有阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦，對于兒童患者而言上述5種復合抗生素與喹諾酮類、氨基糖苷類抗生素相比不良反應較小，而且治療產β-lactamase細菌感染有較好的效果[5]。然而使用β-lactam/β-lactamase inhibitors也會導致患兒有較高的AAD發生率，有研究顯示細菌性重癥肺炎患兒使用阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦AAD發病率均高于其對應的單一β-lactam類抗生素阿莫西林、哌拉西林、頭孢哌酮[2]。為了探究使用β-lactam/β-lactamase inhibitors導致患兒高AAD發病率的原因，研究β-lactam/β-lactamase inhibitors對兒童腸道正常菌群(雙歧桿菌和乳酸桿菌為主)的影響很有必要。有文獻報道阿莫西林/克拉維酸是導致細菌性重癥肺炎患兒高AAD發病率的獨立危險因素[2]。在本研究中，雙歧桿菌和乳酸桿菌對氨芐西林的敏感率分別為77.78%、74.36%，阿莫西林/克拉維酸分別為95.56%、94.87%，由于CLSI對厭氧菌阿莫西林的MIC藥敏解釋標準還未建立，但阿莫西林折點被認為與氨芐西林相同，有限的體外數據表明這兩種藥物對厭氧菌的MIC 值接近，因此筆者用氨芐西林替代阿莫西林與阿莫西林/克拉維酸比較敏感數的差異，結果顯示雙歧桿菌和乳酸桿菌氨芐西林與阿莫西林/克拉維酸的敏感數P值都為0.01，說明阿莫西林/克拉維酸對雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長抑制作用比阿莫西林(氨芐西林)更強。

YILMAZ等[6]研究顯示氨芐西林/舒巴坦是導致血性AAD的重要藥物誘因，在本研究中，雙歧桿菌和乳酸桿菌氨芐西林/舒巴坦的敏感數百分率分別為88.89%、92.31%，雙歧桿菌和乳酸桿菌氨芐西林與氨芐西林/舒巴坦的敏感數P值分別為0.16、0.03，說明氨芐西林/舒巴坦對雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長抑制作用比氨芐西林強。

在本研究中，雙歧桿菌和乳酸桿菌哌拉西林的敏感數百分率分別為73.33%、71.79%，哌拉西林/他唑巴坦分別為91.11%、92.31%，雙歧桿菌和乳酸桿菌哌拉西林與哌拉西林/他唑巴坦的敏感數P值分別為0.03、0.02，說明哌拉西林/他唑巴坦對雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長抑制作用比哌拉西林更強。使用替卡西林/克拉維酸導致患者發生AAD也有報道[7]，本研究顯示雙歧桿菌和乳酸桿菌替卡西林的敏感數百分率分別為68.89%、69.23%，替卡西林/克拉維酸分別為84.44%、89.74%，雙歧桿菌和乳酸桿菌替卡西林與替卡西林/克拉維酸的敏感數P值分別為0.08、0.03，說明替卡西林/克拉維酸對雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長抑制作用比替卡西林強。

頭孢哌酮對β-lactamase的穩定性較差，舒巴坦為廣譜酶抑制劑同時具有較弱的抗菌活性，二者聯合對革蘭陰性桿菌有協同抗菌活性，聯合后的復合物抗菌活性比單獨頭孢哌酮高很多[8]。本研究顯示雙歧桿菌和乳酸桿菌頭孢哌酮的敏感數百分率分別為82.22%、79.49%，由于目前用于藥敏標準指南的CLSI和歐洲抗生素管理委員會(EUCAST)均沒有頭孢哌酮/舒巴坦的藥敏分組與折點標準，無法判斷雙歧桿菌和乳酸桿菌頭孢哌酮/舒巴坦的MIC值，因而無法比較頭孢哌酮與頭孢哌酮/舒巴坦對雙歧桿菌和乳酸桿菌生長的影響大小。

雖然雙歧桿菌和乳酸桿菌不產β-lactamase，但本研究顯示β-lactam/β-lactamase inhibitor比單一β-lactam抗生素抑制雙歧桿菌和乳酸桿菌作用更強，可能的原因有：(1)對β-lactamase陰性感染菌使用β-lactam/β-lactamase inhibitors比β-lactamase陽性感染菌更易導致患兒發生AAD，其原因是對β-lactamase陽性感染菌使用β-lactam/β-lactamase inhibitors，大部分β-lactamase inhibitors會與感染菌的β-lactamase發生不可逆的結合，β-lactamase inhibitors在與β-lactamase作用的過程中本身會遭到破壞[9]，因此沒有或者只有較少剩余的β-lactamase inhibitors作用于人體正常菌群。而對β-lactamase陰性感染菌(例如雙歧桿菌和乳酸桿菌)使用β-lactam/β-lactamase inhibitors，β-lactamase inhibitors會作用于人體腸道產β-lactamase正常菌群(例如脆弱類桿菌等)，導致人體腸道黏膜生物屏障可能被破壞[10]；(2)不合理的使用β-lactamase inhibitors，可能會增加兒童腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌細胞膜的通透性，某些藥物或毒素就會進入細菌細胞內，導致這類細菌生長受到抑制[11]。

筆者的藥敏研究顯示β-lactam/β-lactamase inhibitor比單一β-lactam抗生素抑制兒童腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌效果更強，然而抗生素在人體內會受到其他多種因素的影響，其吸收、運載和代謝的過程非常復雜，今后需要進一步研究β-lactam/β-lactamase inhibitors導致患者發生AAD的詳細機制，以便能合理規范使用β-lactam/β-lactamase inhibitor，盡量考慮治療產β-lactamase細菌感染療效的同時兼顧降低患兒AAD發病率。

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