黃地安消膠囊調控磷脂酰基醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路減輕GK大鼠血管病變損傷程度的研究

韓利平，郭明飛，高家榮,，姜輝，方朝暉，單莉，姜楠楠

(1.安徽中醫藥大學研究生院，安徽 合肥 230038; 2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院、國家中醫藥管理局中藥制劑三級實驗室，安徽 合肥 230031)

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一種以高血糖為臨床特征的代謝性疾病[1]，其中2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)占其發病率的90%以上[2]。糖尿病血管病變以平滑肌細胞、纖維肌細胞的異常增殖所致的血管中膜增厚，外膜纖維化與鈣化為其病理學特征，是T2DM的主要并發癥之一。黃地安消膠囊為國家中醫臨床研究基地(重點研究病種：糖尿病)的特色中藥制劑，對T2DM血管病變具有很好的防治作用[3-4]。有研究表明磷脂酰基醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路在T2DM血管病變過程中發揮重要的調控作用[5]。本實驗以自發性T2DM大鼠為模型，觀察黃地安消膠囊對PI3K/Akt號通路的調控作用，以期闡明黃地安消膠囊對糖尿病血管病變發揮防治作用的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1動物SPF級雄性GK大鼠，60只，5月齡，體質量(200±20)g，購自于上海斯萊克斯實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK(滬)2012-0002。Wistar大鼠10只，SPF級，雄性，5月齡，體質量(200±20)g，購自于安徽醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(皖)2011-002。實驗動物倫理學符合安徽中醫藥大學實驗動物倫理委員會要求。

1.2藥品與試劑鹽酸二甲雙胍片(上海上藥信誼藥廠有限公司，生產批號48160302)；參芪降糖顆粒(魯南厚普制藥有限公司，生產批號00115257)；黃地安消膠囊處方：葛根、生地、麥冬、枇杷葉、黃連、三七，以上所有藥材均由安徽中醫藥大學第一附屬醫院提供，并經李立華主任中藥師鑒定，上述藥材符合2015版《中國藥典》一部，藥材和飲片項下的性狀鑒別標準；Nω-硝基L精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyester，L-NAME，Sigma公司，生產批號N5751-10)；Revert Aid RT Reverse Transcription Kit(美國thermo有限公司)；SYBR?Green PCR Master Mix(美國thermo有限公司)。

1.3主要儀器GA-3型血糖儀(長沙三諾生物傳感股份有限公司)，CX5PRO型全自動生化分析儀(美國Beckman公司)，7500 FAST型Real-time PCR儀(美國ABI公司)。

1.4方法GK大鼠適應性飼養1周后，以隨機血糖>11.1 mmol·L-1作為T2DM的判斷標準[6-7]，選取符合標準的GK大鼠。按隨機數字表法分為模型組、參芪降糖顆粒組(1.08 g·kg-1)、二甲雙胍組(0.72 g·kg-1)、黃地安消膠囊高、中、低劑量組，每組10只，另取10只Wistar大鼠作為健康組。參芪降糖顆粒和二甲雙胍組成人每日給藥劑量分別為(3.00 g和2.00 g)，根據人鼠體表面積換算比例，按臨床等效劑量的4倍給藥，分別為(1.08 g·kg-1和0.72 g·kg-1)。根據黃地安消膠囊處方比例，成人每日需生藥量51 g，根據人鼠體表面積換算比例，計算得出大鼠每日所需生藥量為4.59 g·kg-1，處方浸膏得率為33%，計算得出大鼠每日所需浸膏量為1.51 g·kg-1，按臨床等效劑量的8、4、2倍，設置黃地安消膠囊高、中、低劑量組，給藥浸膏量分別為12.00 g·kg-1、6.00 g·kg-1和3.00 g·kg-1。除健康組外，其余各組均以濃度為0.1 g·kg-1L-NAME加入到飲用水中聯合高脂飼料飼養的方法進行造模，連續6周[8-9]，健康組給予相同溶媒，并喂飼普通飼料。造模第一天按上述劑量灌胃給藥，每天1次，連續6周，健康組和模型組給予等量溶媒。

1.5檢測指標與方法

1.5.1一般形態學觀察 觀察各組大鼠精神、活動狀態、皮毛色澤、飲食量、體重及死亡等情況。

1.5.2空腹血糖(FBG)檢測 分別于造模第0周、2周、4周、6周，各組大鼠禁食12 h，用酒精清潔消毒尾部皮膚，采血針刺破尾靜脈血管，將尾靜脈血滴入血糖儀中，檢測其FBG。

1.5.3血清生化指標檢測 第6周末次給藥后，禁食12 h，腹腔注射3.50%的水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，室溫靜置2 h后，離心分離血清，檢測血膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HLDL)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的含量。

1.5.4腹主動脈病理組織學檢查 分離大鼠腹主動脈，置于10%的甲醛溶液中，采用HE染色觀察大鼠腹主動脈病理組織學損傷程度，Masson染色觀察大鼠腹主動脈膠原纖維變化情況，Verhoeff染色觀察大鼠腹主動脈彈力纖維變化情況。

1.5.5腹主動脈PI3K、PTEN、TRIB3、Akt、HIF-1α、VEGF mRNA的表達 取100 mg大鼠腹主動脈組織，采用TRIzol 法抽提總RNA，42 ℃水浴1 h，經逆轉錄合成第一鏈cDNA。取cDNA 2.5 μL，加入2×qPCR Mix 12.5 μL，正向逆向引物各1 μL，去離子水8 μL，總體系25 μL。反應條件為：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s及60 ℃ 60 s，40個循環。結果采用相對定量法進行分析，目的基因mRNA相對表達量=2-ΔΔCt。各引物序列如表1所示。

表1 引物序列基因

2 結果

2.1一般形態學觀察健康組大鼠精神狀態良好，活潑好動，毛色光亮，飲食飲水量正常；模型組大鼠行動遲緩、反應遲鈍，毛色發黃、蓬松無光澤，飲食飲水量明顯增加，體重增加緩慢[10]；與模型組比較，黃地安消膠囊各劑量組、參芪降糖顆粒和二甲雙胍組精神狀態、活動度、毛色、飲食飲水量等情況具有不同程度的改善。實驗期間，模型組有2只大鼠死亡，其他各組大鼠無死亡。

2.2各組大鼠FBG比較與健康組相比，模型組大鼠2周、4周、6周時，血清FBG水平均顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，黃地安消膠囊高、中劑量組(12.00 g·kg-1、6.00 g·kg-1)4周、6周時，可顯著降低FBG水平(P<0.05或P<0.01)，黃地安消膠囊低劑量組(3.00 g·kg-1)6周時可顯著降低FBG水平。結果見表2。

2.3血清生化指標比較與健康組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL水平均明顯上升(P<0.01)，HDL-C水平顯著下降(P<0.01)。與模型組比較，黃地安消膠囊高、中劑量組(12.00 g·kg-1、6.00 g·kg-1)血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL均顯著下降(P<0.05或P<0.01)，HDL-C水平顯著上升(P<0.05或P<0.01)；黃地安消膠囊低劑量組(3.00 g·kg-1)僅血清ox-LDL水平下降,差異有統計學意義(P<0.05)，其他指標如血清TC、TG、LDL-C水平雖有所下降，HDL-C水平雖有所上升，但均差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表3。

2.4腹主動脈HE染色觀察病理損傷HE染色顯示，健康組大鼠腹主動脈血管內皮細胞平行排列，內膜光滑平整；模型組大鼠腹主動脈血管內皮細胞排列紊亂、腫脹脫落，內膜斷裂不平整，血管平滑肌細胞肥大，血管中膜厚度明顯增加。經黃地安消膠囊藥物干預6周后，各組大鼠腹主動脈病理損傷程度明顯改善，結果見圖1。

表2 黃地安消膠囊對GK大鼠FBG的影響

注：與健康組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01

2.5腹主動脈Masson染色觀察膠原纖維變化Masson染色重點觀察膠原纖維變化情況，以藍色為陽性表達。健康組大鼠腹主動脈管壁膠原纖維分布均勻，相鄰細胞的膠原纖維網完好，血管周圍有少量藍染膠原纖維，纖維化程度輕；模型組大鼠腹主動脈膠原纖維明顯增多，粗大膠原纖維相互連接為團塊狀，排列紊亂，分布不勻，管周纖維化明顯；與模型組比較，各給藥組膠原纖維化明顯好轉，僅黃地安消膠囊低劑量組(3.00 g·kg-1)效果不太明顯，管周有部分藍染纖維，結果如圖2所示。

2.6腹主動脈Verhoeff染色觀察彈力纖維變化Verhoeff染色重點觀察彈力纖維變化情況，以藍黑色或黑色為陽性表達。健康組大鼠腹主動脈彈力纖維分布均勻、整齊，完整無斷裂，呈藍黑色或黑色；模型組大鼠腹主動脈彈力纖維分布不均勻，排列紊亂、疏松，可見明顯斷裂；與模型組比較，黃地安消膠囊各劑量組大鼠腹主動脈彈力纖維排列分布相對均勻整齊，有少量斷裂，參芪降糖組大鼠腹主動脈彈力纖維排列均勻、整齊，斷裂不明顯；二甲雙胍組大鼠腹主動脈彈力纖維排列欠均勻整齊，可見明顯斷裂，結果如圖3所示。

2.7腹主動脈各指標mRNA表達量與健康組比較，模型組大鼠腹主動脈TRIB3、PTEN mRNA水平均顯著下降(P<0.01)，PI3K、Akt 、HIF-1α、VEGF mRNA水平明顯上升(P<0.01)。與模型組比較，黃地安消膠囊高、中劑量組(12.00 g·kg-1、6.00 g·kg-1)腹主動脈TRIB3、PTEN mRNA水平均顯著上升(P<0.05或P<0.01)，PI3K、Akt 、HIF-1α、VEGF mRNA水平明顯下降(P<0.05或P<0.01)；黃地安消膠囊低劑量組(3.00 g·kg-1)雖然TRIB3、PTEN mRNA水平有所上升，PI3K、Akt、HIF-1α、VEGF mRNA有所下降，但均差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表4。

3 討論

糖尿病在中醫中被稱為“消渴病”，主要病變部位在肺、胃、腎三處，“陰津虧耗，燥熱偏盛，進而熱灼津虧血瘀”為其主要病機，“益氣、養陰、活血”為其主要治則。黃地安消膠囊由黃連、生地、三七等六味藥物組成，方中黃連清熱燥濕，生地清熱生津、涼血，三七活血化瘀，麥冬、葛根補陰津虧損，枇杷葉清降肺胃之氣，諸藥合用共湊清熱潤燥、養陰生津、活血之功效，臨床療效確切。

糖尿病血管病變是糖尿病的主要并發癥之一，主要表現為膠原合成的增加、血管壁的逐漸增厚、彈性纖維減少、血管僵硬度增加[11]。因此，血管壁中膜的厚度，膠原、彈性纖維的含量代表了糖尿病血管病變的嚴重程度。本實驗研究發現，給予黃地安消膠囊干預6周后，黃地安消膠囊組大鼠腹主動脈中膜厚度下降，膠原含量減少，彈性纖維的含量增加，說明黃地安消膠囊可有效的抑制糖尿病血管病變的發生與發展。

表3 黃地安消膠囊對GK大鼠血清生化指標的影響

注：與健康組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01，cP<0.05

表4 各組GK大鼠PI3K、TRIB3、PTEN、PI3KP85a、Akt 、HIF-1α、VEGF mRNA的表達

注：與健康組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01，cP<0.05

動脈粥樣硬化是糖尿病血管病變的病理基礎，高血脂是導致動脈粥樣硬化的直接原因[12]。研究認為血管病變與血液中TC、TG、LDL、HLDL、ox-LDL的含量相關，尤其與HLDL、LDL和ox-LDL的含量聯系更為密切[13-15]，治療與防止動脈粥樣硬化的關鍵在于降低TC、TG、LDL、ox-LDL的含量，升高HLDL的含量。本實驗研究發現，黃地安消膠囊能顯著降低血清TC、TG、LDL和ox-LDL水平，升高HLDL水平(P<0.05或P<0.01)。

PI3K/Akt信號通路屬于磷脂酞肌醇信號通路系統，在機體新陳代謝、細胞生長增殖、遷移和凋亡等生物學過程中發揮重要的調控作用[16]。在T2DM的發病過程中，持續的高血糖可激活PI3K/Akt信號通路[17]，催化PIP2轉化為PIP3，誘導Akt活化[18]，從而促進下游靶基因缺氧誘導因子(HIF-1α)的表達[19]。HIF-1α含量的增加又可刺激VEGF的表達，從而引起血管內皮細胞和肌細胞的異常增殖，導致糖尿病血管病變的發生與發展[20-21]。PTEN和TRIB3是調控PI3K/Akt信號通路的重要分子，PTEN可使PIP3去磷酸化，抑制PI3K的磷酸化作用[22]，TRIB3可與Akt結合，抑制Akt活化[23]，阻斷通路下游靶基因的活化，從而對糖尿病血管病變的發生、發展發揮抑制作用。本研究發現，黃地安消膠囊組高、中劑量組(12.00 g·kg-1、6.00 g·kg-1)大鼠腹主動脈TRIB3、PTEN mRNA含量顯著上升(P<0.05或P<0.01)，Akt、VEGF和HIF-1α mRNA含量顯著下降(P<0.05或P<0.01)，說明黃地安消膠囊通過調控PI3K/Akt信號通路對T2DM血管病變發揮防治作用。

綜上，黃地安消膠囊對T2DM血管病變具有一定的防治作用，其機制調控可能與PI3K/Akt信號通路、改善糖脂代謝有關。

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