青藤堿對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠腫瘤壞死因子-α、白介素-17及核因子-κB的影響

張玉萍，姚茹冰，趙智明，蔡輝

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，江蘇 南京 210002 )

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為基本病理表現(xiàn)的自身免疫性疾病，可引起受累關(guān)節(jié)的腫脹疼痛、活動受限，炎癥持續(xù)進(jìn)展可造成對軟骨及骨的破壞，造成關(guān)節(jié)畸形和功能喪失，具有高度的致殘性。青藤堿(sinomenine,SIN)是從中藥青風(fēng)藤中提取的生物堿單體，藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、免疫抑制等作用，對RA有較好的療效[1]。膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型是目前公認(rèn)的RA動物模型之一，本研究建立CIA小鼠模型，通過觀察小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index,AI)評分、血清炎癥因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及白細(xì)胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)、滑膜核因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB)蛋白的變化及SIN的干預(yù)作用，以探索SIN治療RA的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料DBA/1小鼠30只，6周齡，雄性，購于常州卡文斯實驗動物有限公司，使用許可證：SCXK(蘇)2011-0003。青藤堿(正清風(fēng)痛寧片)，湖南正清制藥股份有限公司產(chǎn)品；牛Ⅱ 型膠原、完全弗氏佐劑(CFA)、不完全弗氏佐劑(IFA)，美國Chondrex公司產(chǎn)品；小鼠TNF-α ELISA試劑盒，小鼠IL-17 ELISA試劑盒，深圳欣博盛生物科技有限公司產(chǎn)品；NF-κB p65抗體，英國Abcam公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1動物分組 30只DBA/1小鼠用隨機(jī)數(shù)字表法分成3組：即正常組、CIA組、SIN組，每組各10只，其中CIA組和SIN組的20只小鼠均先誘導(dǎo)建立CIA模型(正常組除外)，在造模及給藥過程中每組小鼠均有意外死亡，至最后實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計，正常組剩余小鼠9只，CIA組9只，SIN組8只。

1.2.2造模 參照文獻(xiàn)[2]方法誘導(dǎo)建立CIA小鼠模型。將牛Ⅱ 型膠原與完全弗氏佐劑等體積研磨配置牛Ⅱ 型膠原乳劑，待乳劑乳化完全，于小鼠尾根部皮內(nèi)免疫注射，分2次注射，每次各100 μL，初次免疫當(dāng)天記為d 1，d21給予加強免疫注射。

1.2.3關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分 d 27開始根據(jù)各組小鼠關(guān)節(jié)腫脹情況進(jìn)行AI評分，每周一次，評分標(biāo)準(zhǔn)[3]：0分，無關(guān)節(jié)腫脹；1分，足趾關(guān)節(jié)腫脹；2分，趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)整個足爪嚴(yán)重紅腫。各關(guān)節(jié)累計積分為各小鼠的AI評分，每只最高分為16分。

1.2.4給藥 d 28開始根據(jù)組別予不同處理，SIN組予每日青藤堿藥液100 mg·kg-1灌胃，正常組及CIA組予生理鹽水作為對照，連續(xù)給藥20 d。

1.2.5外周血采集及酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)

采取摘眼球法收集小鼠全血，靜置離心，收集血清，放置-20 ℃儲存?zhèn)溆谩０凑誆LISA試劑盒說明書步驟檢測血清TNF-α、IL-17水平。

1.2.6滑膜采集及蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot) 處死小鼠后，仰臥位固定其頭部和四肢，沿膝關(guān)節(jié)正中縱行切開皮膚，暴露膝關(guān)節(jié)中心約 3 cm × 3 cm的區(qū)域，用齒鑷提起髕骨，剝離完整的膝關(guān)節(jié)滑膜組織，參照說明書提取滑膜蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗及二抗孵育完成滑膜NF-κB蛋白檢測。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較造模d 24小鼠關(guān)節(jié)開始發(fā)紅腫脹，關(guān)節(jié)炎發(fā)病，隨著時間的延長，小鼠關(guān)節(jié)紅腫情況加重，伴關(guān)節(jié)活動受限，無法承重。CIA組小鼠較正常組AI評分均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與CIA組比較，造模d 41和d 48，SIN組小鼠AI評分則明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(d 41,P<0.01;d 48,P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠AI評分比較/(分，

注：與正常組比較，aP<0.01；與CIA組比較，bP<0.01，cP<0.05

2.2各組小鼠血清TNF-α、IL-17及滑膜NF-κB蛋白比較各組間血清TNF-α表達(dá)水平有明顯差異，其中CIA組較正常組和SIN組均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，SIN組TNF-α水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組間血清IL-17表達(dá)水平有明顯差異，其中CIA組較正常組和SIN組均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，SIN組IL-17水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組間滑膜NF-κB蛋白表達(dá)差異顯著，其中CIA組NF-κB蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；SIN組NF-κB蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

3 討論

本實驗采用DBA/1小鼠的CIA模型，系因CIA模型是研究RA最常用的模型之一，且其發(fā)病機(jī)制與RA有多方面的共同之處，包括滑膜增生、單核細(xì)胞浸潤、軟骨破壞等[2]，DBA/1小鼠是誘導(dǎo)CIA模型的敏感種系，關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率可達(dá)80%～100%，造模成功率高。本實驗觀察造模小鼠d 24關(guān)節(jié)炎開始發(fā)病，d 40左右關(guān)節(jié)腫脹達(dá)到高峰，本次造模的成功率為80%。SIN是從中藥青風(fēng)藤中提取的有效成分，研究發(fā)現(xiàn)，SIN可降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)腫脹，降低關(guān)節(jié)炎大鼠的機(jī)械痛和熱痛[4]，并能降低CIA小鼠血清IL-1β、IL-6的水平[5]。本實驗結(jié)果顯示，造模d 27 CIA組小鼠的AI評分較正常組顯著升高，d 28開始予SIN治療2周后，SIN組小鼠的AI評分較CIA組明顯降低，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SIN能明顯改善CIA小鼠的關(guān)節(jié)腫脹，對關(guān)節(jié)炎有較好的治療作用。

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-17及滑膜NF-κB蛋白比較

注：與正常組比較，aP<0.01，cP<0.05；與CIA組比較，bP<0.05

TNF-α是NF-κB活化后產(chǎn)生的重要炎癥介質(zhì)，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，其能誘導(dǎo)其他前炎癥細(xì)胞因子如IL-1、IL-6的產(chǎn)生，促使趨化因子的釋放，活化蛋白水解酶和金屬蛋白酶，破壞關(guān)節(jié)軟骨等，在RA關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮重要作用[6-7]。IL-17是較晚發(fā)現(xiàn)的炎癥細(xì)胞因子，有強大的致炎作用。IL-17在RA患者滑膜中表達(dá)水平升高，且會刺激多種趨化因子的表達(dá)，募集嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞至關(guān)節(jié)滑膜，加重關(guān)節(jié)炎癥和損傷[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)SIN能下調(diào)血清IL-17的表達(dá)以改善CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥[10]。NF-κB是廣泛表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子，在多種疾病的炎性位點高度活化，與關(guān)節(jié)炎的發(fā)生密切相關(guān)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB在CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中的表達(dá)明顯升高，NF-κB的活化能抑制RA成纖維樣滑膜細(xì)胞(RA-FLS)的凋亡，促進(jìn)RA-FLS相關(guān)細(xì)胞因子和蛋白酶的分泌[12]。口服NF-κB抑制劑咪唑啉可明顯改善關(guān)節(jié)炎模型小鼠的關(guān)節(jié)炎癥、血管翳形成、軟骨損傷等癥狀[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，CIA組小鼠血清TNF-α、IL-17及滑膜NF-κB蛋白的表達(dá)均明顯升高(P<0.01或<0.05)，與既往的研究結(jié)果一致，且SIN干預(yù)后，可顯著抑制血清TNF-α、IL-17及滑膜NF-κB蛋白的表達(dá)(P<0.05)，減輕CIA小鼠的關(guān)節(jié)炎癥。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SIN可下調(diào)CIA小鼠滑膜NF-κB的表達(dá)，抑制血清TNF-α、IL-17的分泌，改善小鼠關(guān)節(jié)炎癥，其可能是SIN治療RA作用機(jī)制之一，為SIN治療RA提供一定的實驗依據(jù)。

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