高效液相色譜波長切換法聯(lián)合梯度洗脫法同時測定理氣散結顆粒中6種成分的研究

王育，王毅，嚴亨波，魏譚軍，李霞

(1.達州市食品藥品檢驗所中藥檢測室，四川 達州 635000；2.達州市中西醫(yī)結合醫(yī)院制劑室，四川 達州 635000)

理氣散結顆粒為達州市中西醫(yī)結合醫(yī)院的醫(yī)院制劑，是經(jīng)白芍、柴胡、延胡索等10味中藥材提取濃縮成稠膏后加入適量輔料制成的顆粒劑。方中白芍柔肝平肝為君藥，配以柴胡、延胡索疏肝解郁，可恢復肝正常的順達之性，治療肝郁血瘀之證。為有效控制理氣散結顆粒的產(chǎn)品質(zhì)量和療效一致性，本文作者采用高效液相色譜(HPLC)波長切換法聯(lián)合梯度洗脫法同時測定理氣散結顆粒中的芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿，對理氣散結顆粒的全面質(zhì)量控制具有重要意義和應用價值。

1 儀器與試藥

1.1儀器島津LC-20AT 高效液相色譜儀(日本島津公司)；XS105DU分析天平(精度：0.01 mg，METTLER TOLEDO公司)；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2試藥與試劑對照品芍藥苷(批號110736-201640，含量95.2%，2～10 ℃冷處保存)、柴胡皂苷a(批號110777-201510，含量93.2%，冷凍保存)、柴胡皂苷d(批號110778-201510，含量97.3%，冷凍保存)、延胡索乙素對照品(批號110726-201617，含量99.8%，2～10 ℃冷處保存)均來源于中國食品藥品檢定研究院；對照品去氫紫堇堿(批號30045-16-0，含量97.5%)來源于成都德思特生物技術有限公司；對照品紫堇堿(批號518-69-4，含量98.0%)來源于寶雞市辰光生物科技有限公司；理氣散結顆粒(每袋裝15 g)來源于達州市中西醫(yī)結合醫(yī)院制劑室；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1供試品溶液的制備取本品內(nèi)容物適量，混勻，研細，取約5.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷至室溫，用70%乙醇補足減失重量，搖勻，過濾，即得供試品溶液。

2.2對照品溶液的制備分別精密稱取芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿對照品各適量，用70%乙醇制成單一成分對照品儲備溶液(芍藥苷2.878 g·L-1、柴胡皂苷a 0.392 g·L-1、柴胡皂苷d 0.288 g·L-1、延胡索乙素0.272 g·L-1、去氫紫堇堿0.316 g·L-1、紫堇堿0.424 g·L-1)。依次精密量取各對照品儲備液5.0 mL、5.0 mL、5.0 mL、5.0 mL、5.0 mL和2.5 mL，定容至100 mL，用70%乙醇制成混合對照品溶液。

2.3三種陰性樣品溶液的制備依據(jù)理氣散結顆粒的處方和生產(chǎn)工藝，制備缺白芍陰性樣品、缺柴胡陰性樣品和缺延胡索陰性樣品，依據(jù)供試品溶液制備方法制成白芍陰性樣品溶液、柴胡陰性樣品溶液和延胡索陰性樣品溶液。

2.4色譜條件Agilent TC- C18色譜柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.1%冰醋酸溶液，梯度洗脫(0～11 min，18.0%A；11～17 min，18.0%A→32.0%A；17～29 min，32.0%A→55.0%A；29～44 min，55.0%A→80.0%A；44～50 min，80.0%A→18.0%A)；0～17 min在230 nm[1-4]波長下檢測芍藥苷，17～29 min在210 nm[5-6]波長下檢測柴胡皂苷a和柴胡皂苷d，29～50 min在280 nm[7-11]波長下檢測延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃。

2.5系統(tǒng)適用性及專屬性試驗取“2.1 供試品溶液”“2.2 對照品溶液”“2.3 三種陰性樣品溶液”和空白溶劑，依法進樣測定，記錄色譜峰，各陰性樣品溶液色譜圖中，在所測芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿6種成分對應的位置處無干擾(圖1)，理論塔板數(shù)按芍藥苷計不低于3 500，分離度符合藥典要求。

2.6線性關系考察精密量取芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿對照品儲備液各0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL，分別置20 mL量瓶中，用70%乙醇定容，制成25倍濃度差的6種不同濃度混合對照品溶液，依法進樣測定芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿的峰面積，以芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿的質(zhì)量濃度(mg·L-1)為橫坐標(x)，所測各成分的峰面積為縱坐標(y)，進行線性回歸(表1)。

表1 線性關系實驗結果

2.7加樣回收率試驗分別精密稱取芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿對照品各適量，用70%乙醇制成單一成分的加樣對照品溶液(芍藥苷0.761 g·L-1、柴胡皂苷a 0.539 g·L-1、柴胡皂苷d 0.409 g·L-1、延胡索乙素0.299 g·L-1、去氫紫堇堿0.431 g·L-1、紫堇堿0.247 g·L-1)。

稱取已知含量批號為20160909的理氣散結顆粒6份，每份約2.5 g，精密稱定，分別精密加入上述各成分對照品溶液5.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、70%乙醇40 mL，按供試品溶液制備方法制備加樣回收樣品溶液，依法進樣測定，計算芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿平均加樣回收率及RSD值(表2)。

2.8精密度試驗取“2.2”項下混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結果芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿峰面積的RSD(n=6)分別為0.62%、1.15%、0.72%、0.94%、1.18%和0.55%。

2.9重復性試驗稱取批號為20160909的理氣散結顆粒6份，按照供試品溶液制備方法制成供試品溶液，依法進樣測定，分別計算芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿的含量，結果6種組分含量的RSD分別為1.22%、0.89%、1.39%、0.67%、0.43%和1.70%。

2.10穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，分別于室溫下0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、16 h進樣測定，結果供試品溶液室溫下16 h內(nèi)穩(wěn)定，芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿峰面積的RSD分別為1.08%、0.65%、0.82%、0.96%、0.77%和1.31%。

2.11樣品含量測定取3批次樣品，依據(jù)供試品溶液制備方法制備供試品溶液，依法進樣測定，結果見表3。

表3 理氣散結顆粒樣品含量測定結果/mg·g-1

3 討論

3.1提取方法的選擇在供試品溶液提取方法上，作者分別嘗試了回流提取和超聲提取，結果回流提取和超聲提取所測6種成分芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿的測定結果差異無統(tǒng)計學意義，選取操作簡便的超聲提取作為供試品溶液的提取方式；在此實驗基礎上，作者又考察了不同的超聲提取時間(15 min、30 min、60 min)和提取溶劑(50%乙醇[1]、70%乙醇[8]、95%乙醇、甲醇[9])，結果超聲提取15 min所測成分含量測定結果偏低，超聲提取30 min和超聲提取60 min，所測成分含量較高。以70%乙醇為提取溶劑時，所測各成分綜合提取率最佳，故最終選取70%乙醇超聲提取30 min作為理氣散結顆粒供試品溶液的制備方法。

表2 理氣散結顆?；厥章蕦嶒灲Y果

3.2流動相的選擇作者在本研究中分別對甲醇-水流動相體系[12]、乙腈-水流動相體系[13-14]、乙腈-0.1%磷酸溶液流動相體系[9,15-16]、乙腈-0.1%冰醋酸溶液流動相體系[6]進行了對比考察，以色譜峰基線平穩(wěn)情況和所測成分芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿的峰形及分離度為指標，優(yōu)選最佳的流動相體系，結果以乙腈-0.1%冰醋酸溶液為流動相按照文中的梯度洗脫進行洗脫時，色譜峰基線平穩(wěn)，所測各成分峰形較好，分離度符合中國藥典規(guī)定。

3.3測定方法的選擇理氣散結顆粒為中藥復方制劑，所含成分復雜，不同活性成分的最大吸收波長差異較大，單一波長難以同時測定多種活性成分的含量。本研究采用波長切換技術，提高了所測定成分的靈敏性和檢測結果的準確性，同時聯(lián)合梯度洗脫技術，提高了所測各成分的分離效果，縮短了檢測時間，實現(xiàn)了對理氣散結顆粒中芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿6種成分的同時測定。同時HPLC波長切換聯(lián)合梯度洗脫法對中藥復方制劑多成分同時測定存在對照品使用量較大、檢測成本高等不足之處，采用一測多評法對理氣散結顆粒中多成分同時測定還在進一步研究中。

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