膜聯蛋白A1基因的表達與膽囊癌臨床病理的關系及調控信號轉導與轉錄因子3信號通路對膽囊癌細胞增殖凋亡的影響

江若霞 ,趙麗敏

(1.河南醫學高等專科學校醫學系，河南 鄭州 451191；2.河南大學附屬鄭州市第一人民醫院病理科，河南 鄭州 450004)

膽囊癌是常見的消化系統惡性腫瘤，發病的機制及病因復雜，診斷困難，但大部分患者在確診時已處于晚期，手術的切除率很低[1]。因此，尋找診斷和預防的方法進行早期治療具有重要意義。膜聯蛋白A1(annexin A1，ANXA1)是鈣離子依賴磷脂蛋白結合家族中的一員，其具有參與調控炎性反應、凝血過程、鈣離子通道的形成、細胞的凋亡和分化等多種生物學功能[2-4]。研究顯示，ANXA1在胃癌、結腸癌、肝癌等腫瘤中表達增強，而在前列腺癌、宮頸癌等腫瘤中表達降低[5-6]，這說明ANXA1在腫瘤的發生中具有重要影響。鑒于此，本研究通過免疫組化檢測ANXA1在膽囊癌中表達，研究其對膽囊癌細胞增殖凋亡的影響及機制，以期為膽囊癌的診斷和治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料 收集河南大學附屬鄭州市第一人民醫院2014年8月至2016年8月期間進行膽囊癌切除手術的患者100例，其中男性40例，女性60例，年齡范圍31～85歲，平均年齡為65.82歲。術前未行放化療，術后病理報告均為腺癌。術后按照常規的病理學檢查確定組織學類型、腫瘤的分化程度。按照WHO的分級標準分為高(G1，18例)、中(G2，42例)、低(G3，36例)分化組和未分化組(G4，4例)。病理分期按照Nevin標準分為五期，其中0期4例，Ⅰ期23例，Ⅱ期34例，Ⅲ期20例，IV期19例。無淋巴轉移41例，有淋巴轉移59例。從100例膽囊癌組織臘塊標本中隨機抽取40例，取癌旁組織作為對照組，其中男性15例，女性25例，平均年齡為61.26歲。所有的樣品采集均經過患者及其近親屬的知情同意及河南大學附屬鄭州市第一人民醫院醫學倫理委員會審核通過。

1.1.2細胞 人膽囊癌GBC-SD細胞株購自鄭州大學。

1.1.3主要試劑和儀器 胎牛血清、胰酶、青鏈霉素均購自美國Gibco公司；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3)、信號轉導與轉錄因子3(Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)、磷酸化的信號轉導與轉錄因子3(Phosphorylated Signal transducers and activators of transcription 3,p-STAT3)單克隆抗體及ANXA1多克隆抗體和辣根過氧化物標記的二抗均購自美國abcam公司；小干擾RNA-陰性對照(siRNA-NC)組、ANXA1-siRNA購自上海生工生物工程有限公司；DAB顯色試劑盒購自TIANGEN BIOTECH北京有限公司；Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自碧云天生物技術研究所；細胞計數(Cell Counting Kit-8，CCK8)試劑盒購自日本Dongji公司；二氧化碳細胞培養箱購自德國Heraeus公司；酶標儀購自TECAN公司；流式細胞儀購自美國Becton Dickinson公司。

1.2方法

1.2.1免疫組化及結果判定 將厚度為4 μm的蠟塊切片放置于載玻片上，室溫條件下去除液體，脫蠟過程使用二甲苯，脫水過程使用酒精，在3% 雙氧水條件下孵育20 min后，用0.1%的胰蛋白酶消化反應15 min，PH7.4的PBS洗滌3遍，甩去PBS液，加入1∶80稀釋的ANXA1多克隆抗體，孵育70 min，重新清洗3次，加入辣根過氧化物標記的山羊抗兔，DAB顯色，蘇木精復染，乙醇脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ分別浸泡2 min、5 min，中性樹膠封片。PBS作為陰性對照，相應抗體的陽性切片作為陽性對照。以Olympus數碼顯微成像系統進行采集、分析。隨機選擇10個視野，400倍觀察，測定每個視野下陽性反應的平均吸光度值(IOD)，根據IOD統計陽性細胞的比例。

1.2.2細胞培養 取出保存于液氮罐中的人膽囊癌GBC-SD細胞株，置于37 ℃的水浴鍋中溶解，轉移溶解的細胞至一個新的離心管中，向離心管中加入含有10%胎牛血清、100 mg·L-1鏈霉素和1×105U·L-1青霉素的RPMI1640培養基，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入細胞培養液懸浮細胞，接種至細胞培養瓶中，置于37 ℃，5% 二氧化碳培養箱中培養。細胞長滿皿底90%以上時，0.25%胰酶消化細胞，用完全培養基終止消化，按照實驗需要進行傳代。細胞進入對數生長期再用于實驗研究。

1.2.3細胞轉染 將生長至對數期的人膽囊癌GBC-SD細胞株以106個/毫升每孔加2 mL接種于6孔細胞培養板中。細胞培養24 h后，按照Lipofectamine 2000轉染說明將siRNA-NC(轉染對照)、ANXA1-siRNA轉染到細胞內，各轉染100 nmol·L-1，對照組不轉染，將各組細胞與培養基充分混合后加入到人膽囊癌GBC-SD細胞，置于37 ℃，5% 二氧化碳培養箱中培養4 h，觀察到細胞融合度達到80%以上時，用不含血清的RPMI1640培養基繼續培養細胞24 h，更換成含血清的RPMI1640培養基繼續培養。

1.2.4轉染效果檢測 取生長至對數期的上述三組細胞，1 000 r·min-1，離心5 min，加入適量的Trizol置于冰上裂解反應30 min后，4 ℃，14 000 r·min-1，離心15 min，吸取蛋白上清液，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒檢測提取的蛋白濃度。將蛋白樣品和上樣緩沖液充分混勻，100 ℃條件下變性5 min，將蛋白加入到SDS-PAGE凝膠孔中進行電泳，電泳結束后4 ℃轉膜1.5 h，5%的脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，以1∶500稀釋的ANXA1單克隆抗體作為一抗，4 ℃孵育過夜，TBST清洗后加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h，TBST清洗后加入增強型化學法(ECL)發光劑顯影，自動凝膠成像系統采集圖像。以GAPDH作為內參，分析蛋白表達水平。

1.2.5細胞增殖檢測 將生長至對數期的上述三組細胞，以5×103個/毫升每孔100 μL細胞懸液接種于96孔細胞培養板中，置于37 ℃，5%二氧化碳濃度培養箱中培養48 h后，向每孔細胞中加入10 μL CCK8溶液，置于37 ℃，5% 二氧化碳培養箱孵育3 h，酶標儀在波長為490 nm處測定并記錄OD值，計算細胞增殖率。細胞增殖率=(轉染組細胞OD/對照組細胞OD)×100%

1.2.6細胞凋亡檢測 取上述三組細胞，0.25%的胰蛋白酶消化細胞，調整細胞濃度為每毫升還有2×105個細胞，接種細胞至96孔細胞培養板中培養48 h后，取1 mL細胞懸液轉移至離心管中，4 ℃，1 000 r·min-1，離心8 min，棄上清，洗滌細胞后加入200 μL結合緩沖液，然后加入PI和 Annexin-V各5 μL，室溫避光條件下反應20 min后，再加入400 μL結合緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.7蛋白質印跡法檢測STAT3、p-STAT3蛋白表達 取上述三組細胞，按照1.2.4的方法檢測STAT3、p-STAT3蛋白表達。

1.3統計學方法數據采用SPSS 21.0統計軟件進行分析。觀測資料中的計量數據，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。以P<0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1ANXA1基因在膽囊癌及癌旁組織中的表達

ANXA1在膽囊癌中陽性表達69例，陽性率為69.0%，對照組陽性表達3例，陽性率為7.5%，兩組之間ANXA1陽性表達差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 ANXA1基因在膽囊癌及癌旁組織中的表達/例

注：兩組比較，aχ2=43.261,P<0.01

2.2ANXA1表達與膽囊癌臨床病理參數之間的關系如表2所示，ANXA1在膽囊癌中的表達與性別、年齡不相關(P>0.05)，與腫瘤的分化程度、臨床分期、淋巴轉移顯著相關(P<0.01)。

表2 ANXA1表達與膽囊癌臨床病理參數之間的關系/例(%)

2.3轉染后細胞中ANXA1的表達及對細胞增殖的影響空脂質體、siRNA-NC、ANXA1-siRNA 轉染人膽囊癌GBC-SD細胞后培養48 h，siRNA-NC組細胞中ANXA1蛋白表達率為0.335±0.031，細胞存活率為(97.02±1.46)%，與對照組[0.342±0.035，(97.15±1.51)%]比較差異無統計學意義(P=0.346)；ANXA1-siRNA組細胞中ANXA1蛋白表達率為0.141±0.018，細胞存活率為(51.54±3.31)%，顯著低于對照組(P=0.003～0.006 )。見圖1。

2.4抑制ANXA1的表達促進細胞凋亡流式細胞儀檢測空脂質體、siRNA-NC、ANXA1-siRNA 轉染人膽囊癌GBC-SD細胞后培養48 h的細胞凋亡情況，結果顯示，siRNA-NC組細胞凋亡率為(3.42±0.68)%，Cleaved caspase3蛋白表達率為0.162±0.017，與對照組[(3.35±0.62)%，0.154±0.015]比較差異無統計學意義(P=0.523)；ANXA1-siRNA組細胞凋亡率為(17.14±2.02)%，Cleaved caspase3蛋白表達為0.411±0.038，顯著高于對照組(P=0.002～0.005)(圖2)。

注：1為對照組，2為siRNA-NC組，3為ANXA1-siRNA組；與對照組比較，aP=0.002～0.005

2.5抑制ANXA1的表達對STAT3、p-STAT3蛋白表達的影響蛋白質印跡法檢測上述三組細胞轉染人膽囊癌GBC-SD細胞培養48 h后的STAT3、p-STAT3蛋白表達，結果顯示，siRNA-NC組STAT3蛋白表達率為0.468±0.040，p-STAT3蛋白表達率為0.220±0.031，與對照組(0.462±0.039，0.216±0.026)比較差異無統計學意義(P=0.421)；ANXA1-siRNA組p-STAT3蛋白表達率為0.094±0.011，顯著低于對照組(P=0.002～0.004)，三個組STAT3蛋白表達均差異無統計學意義(P=0.332)(圖3)。

注：1為對照組，2為siRNA-NC組，3為ANXA1-siRNA組；與對照組比較，aP=0.002～0.004

3 討論

膜聯蛋白超家族有A、B、C、D、E五組，在人類的組織中僅存在A組，A組有13個成員，其中ANXA1是最早發現的成員。ANXA1屬于胞質蛋白，在各種細胞內廣泛存在，占細胞中蛋白質總含量的0.5%～2%，它既可以可溶性的形式存在，也可以穩定或可逆的形式結合在細胞骨架蛋白上[7-8]。其功能具有多樣性，包括參與炎性反應、細胞凋亡和分化及信號傳遞等生命活動，在不同腫瘤中的表達有明顯的差異，且在同一種腫瘤的不同形式中也有可能不同。在不同組織中ANXA1的不同表達均可引起腫瘤的發生，目前尚無合理的解釋[9-11]。

注：1為對照組，2為siRNA-NC組，3為ANXA1-siRNA組；與對照組比較，aP=0.003～0.006

本研究中旨在探究ANXA1對膽囊癌發生發展的關系及機制。研究顯示，ANXA1在食管腺癌中高表達，其表達與腫瘤的病理分期及淋巴轉移密切相關，ANXA1的表達越高，腫瘤的分期越高，腫瘤的復發率越高[12]。在鼻咽癌中ANXA1低表達，其表達與淋巴轉移及遠處轉移有關[13]。在胃癌的研究中發現ANXA1表達越低，腫瘤的惡性程度越高[14]。本研究檢測ANXA1在膽囊癌中的陽性表達及與病理關系進行分析，結果顯示，ANXA1在膽囊癌中的陽性表達顯著高于相應的癌旁組織，且表達與腫瘤的分化程度、臨床分期、淋巴轉移顯著相關。

RNA干擾是一種能引起內源性靶基因沉默的機制，是研究基因功能有效的方法[15]。研究顯示，ANXA1在前列腺癌中高表達，沉默ANXA1的表達后能顯著促進人前列腺癌細胞的凋亡[16]。胰腺癌中沉默ANXA1的表達能阻滯癌細胞于G1期并誘導細胞凋亡[17]。本研究中，檢測沉默ANXA1的表達對膽囊癌細胞增殖凋亡的影響，結果顯示，沉默ANXA1的表達能顯著抑制人膽囊癌GBC-SD細胞增殖，并促進細胞凋亡和上調Cleaved caspase3蛋白的表達。細胞凋亡是細胞程序性死亡過程，主要有半胱氨酸蛋白酶的級聯反應引起，caspase3處在caspase級聯反應的下游，為細胞凋亡過程中的共同效應蛋白，被稱為“凋亡的執行者”[18-19]。本研究的結果說明沉默ANXA1的表達，通過上調Cleaved caspase3蛋白的表達引起人膽囊癌細胞的凋亡。

酪氨酸激酶JAK/轉錄因子STAT(Janus kinase/Signal transducers and activators of transcription 3,JAK/STAT3)是近些年新發現的一個信號轉導通路，由JAKS蛋白家族和STAT蛋白家族組成，該通路與腫瘤的增殖、分化等生物學特性密切相關[20]。STAT3是STAT家族中的一員，參與細胞的增殖、凋亡、分化等過程，該通路受到細胞因子、生長因子刺激后，可作用于細胞核內的特異性DNA片段，對靶基因的轉錄進行調控，從而使通路激活，導致細胞的增殖異常和惡性轉化[21]。本研究中檢測沉默ANXA1的表達對STAT3信號通路的影響，結果顯示沉默ANXA1的表達后能顯著抑制p-STAT3蛋白表達。

綜上所述，ANXA1基因的表達參與了膽囊癌的生長、分化和遷移過程，下調 ANXA1的表達能抑制人膽囊癌GBC-SD細胞的增殖，并通過下調Cleaved caspase3蛋白促進細胞凋亡，其機制與STAT3信號通路的調控有關。該研究為膽囊癌的早期診斷和治療提供了理論依據。

[1] BAIG M，GUARINO M，PETRELLI N.Report on demographics of gall bladder cancer in Delaware and retrospective review of treatment strategies for gallbladder cancer in a large community cancer center[J].Surg Onco,2016,25(2):86-91.

[2] ZHANG X，LI X,ZHENG L,et al.ANXA1 silencing increases the sensitivity of cancer cells to low-concentration arsenic trioxide treatment by inhibiting ERK MAPK activation[J].Tumori,2015,101(4):360-367.

[3] KREFT S，KLATT AR，STRABBURGER J，et al.Skin wound repair is not altered in the absence of endogenous AnxA1 or AnxA5,but pharmacological concentrations of AnxA4 and AnxA5 inhibit wound hemostasis[J].Cells Tissues Organs,2016,201(4):287-298.

[4] YDY LR，DO ESPRITO SANTO GF，DE MENEZES I ,et al.Study of the Annexin A1 and its associations with carcinoembryonic antigen and mismatch repair proteins in colorectal cancer[J].Journal of Gastrointestinal Cancer,2016,47(1):61-68.

[5] PREVETE N，LIOTTI F，VISCIANO C， et al.The formyl peptide receptor 1 exerts a tumor suppressor function in human gastric cancer by inhibiting angiogenesis[J].Oncogene,2015,34(29):3826-3838.

[6] PATHAK BR，BREED AA，APTE S，et al.Cysteine-rich secretory protein 3 plays a role in prostate cancer cell invasion and affects expression of PSA and ANXA1[J].Mol Cell Biochem,2016,411(1-2):11-21.

[7] 賈浩楠,梅軼芳,張志毅.膜聯蛋白 A1 在類風濕關節炎中的研究進展[J].中華內科雜志,2015,54(6):551-553.

[8] LINKE B，ABELER-D?RNER L，JAHNDEL V， et al.The tolerogenic function of annexins on apoptotic cells is mediated by the annexin core domain[J].J Immunol,2015,194(11):5233-5242.

[9] 李遼,尚培中.膜聯蛋白 A1 在消化系統腫瘤中的研究進展[J].中國現代普通外科進展,2015,18(7):543-546.

[10] HUANG Y，ZHANG C，CHEN C,et al.Investigation of circulating antibodies to ANXA1 in breast cancer[J].Tumour Biol,2015,36(2):1233-1236.

[11] PRATES J，FRANCO-SALLA GB，DINARTE DOS SANTOS AR,et al.ANXA1Ac peptide reduces ID1 expression in cervical carcinoma cultures[J].Gene,2015,570(2):248-254.

[12] KAILASAM A，MITTAL SK，AGRAWAL DK.Epigenetics in the pathogenesis of esophageal adenocarcinoma[J].Clin Transl Sci,2015,8(4):394-402.

[13] CAI XZ，ZENG WQ，XIANG Y,et al.iTRAQ‐based quantitative proteomic analysis of nasopharyngeal carcinoma[J].J Cell Biochem,2015,116(7):1431-1441.

[14] LI Y，WANG L，KANG A,et al.Screening and identification of proteins related to gastric cancer metastasis with comparative proteomics[J].Journal of Southern Medical University,2015,35(3):360-364.

[15] 劉丹丹,鄭翔宇,劉奔,等.siRNA 沉默 Bmi-1 表達對肺腺癌 A549 細胞侵襲能力的影響[J].中國老年學雜志,2015,35(13):3518-3520.

[16] WEBBER JP，SPARY LK，MASON MD,et al.Prostate stromal cell proteomics analysis discriminates normal from tumour reactive stromal phenotypes[J].Oncotarget,2016,7(15):20124-20139.

[17] PADDEN J，AHRENS M，KLSCH J,et al.Immunohistochemical markers distinguishing cholangiocellular carcinoma (CCC) from pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) discovered by proteomic analysis of microdissected cells[J].Mol Cell Proteomics,2016,15(3):1072-1082.

[18] 許俏,羅俊,潘年松,等.Caspase-3/Caspase-9 活化與皮鱗癌 1 號方抑制 A431 細胞生長的關系研究[J].安徽醫藥,2015,19(1):23-27.

[19] KATAYAMA S，SHIMODA K，TAKENAGA Y.Loss of ADAR1 in human iPS cells promotes caspase3‐mediated apoptotic cell death[J].Genes to Cells,2015,20(8):675-680.

[20] VILLARINO AV，KANNO Y，FERDINAND JR,et al.Mechanisms of Jak/STAT signaling in immunity and disease[J].J Immunol,2015,194(1):21-27.

[21] LIU S,SUN J,CAI B,et al.NANOG regulates epithelial-mesenchymal transition and chemoresistance through activation of the STAT3 pathway in epithelial ovarian cancer[J].Tumour Biol,2016,37(7):9671-9680.