雌激素受體α、β及基質(zhì)金屬蛋白酶-9在人甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及意義

陳素琴，袁海洪，馮立新

(天津市武清區(qū)人民醫(yī)院病理科，天津 301700)

甲狀腺腫瘤占所有腫瘤的1%，其中大部分為內(nèi)分泌惡性腫瘤[1]，并且其發(fā)生率在近幾年快速增加[2]，尤其是甲狀腺乳頭狀癌(PTC)[1]。PTC的男女發(fā)病率之比為1∶4，提示雌激素在PTC的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用，雌激素經(jīng)典的信號(hào)通路是由兩個(gè)細(xì)胞內(nèi)受體介導(dǎo)的，即雌激素受體α(ERα)和雌激素受體β(ERβ)。而基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)異常與人類惡性腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。為了研究ERα、ERβ對(duì)人類PTC中癌細(xì)胞的遷移和侵襲的影響，我們采用免疫組織化學(xué)(免疫組化)法檢測(cè)ERα、ERβ和MMP-9在200例PTC組織和100例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫(NTG)中的表達(dá)，探討三者與PTC臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2003年6月至2016年7月間天津市武清區(qū)人民醫(yī)院病理科常規(guī)外檢的200例PTC和100例NTG患者切除的組織包埋塊。其中PTC患者中男性47例，女性153例；年齡范圍25～60歲，中位年齡45歲；腫瘤≥2 cm者86例，<2 cm者114例；有包膜侵犯者107例，無(wú)包膜侵犯者93例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者79例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者121例；根據(jù)TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期134例，Ⅲ～Ⅳ期66例。所有病例在腫瘤切除前均未進(jìn)行放療和化療。所有病例均經(jīng)兩位副主任醫(yī)師以上病理醫(yī)師閱片明確診斷為PTC和NTG。

本研究經(jīng)天津市武清區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其近親屬知情同意。

1.2研究方法免疫組化Elivision兩步法 將準(zhǔn)備好的石蠟組織塊，切成石蠟切片，置于67 ℃烘箱中，烘片2 h，脫蠟至水，用pH 7.4的PBS沖洗3次，每次3 min。取一定量pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液，加入微波盒中，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔微波處理10 min，取出微波盒流水自然泠卻，從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS沖洗2次，每次3 min。每張切片加1滴3%雙氧水，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加1滴相應(yīng)的第一抗體，室溫下孵育2 h。PBS沖洗3次，每次5 min。除去PBS液，每張切片加1滴聚合物增強(qiáng)劑(試劑A)，室溫下孵育20 min。PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加1滴酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物(試劑B)，室溫下孵育30 min。PBS沖洗3次，每次5 min。除去PBS液，每張切片加1滴新鮮配制的DAB液，顯微鏡下觀察5 min。蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸分化，自來(lái)水沖洗，藍(lán)化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干后觀察。

1.3材料與試劑單克隆兔抗人ERα抗體為abcam公司產(chǎn)品，工作液濃度為1∶100；單克隆兔抗人ERβ抗體為abcam公司產(chǎn)品，工作液濃度為1∶200；單克隆兔抗人MMP-9抗體為abcam公司產(chǎn)品，工作液濃度為1∶200。即用型第二代免疫組化Elivision plus廣譜試劑盒，購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，用已知陽(yáng)性切片做陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4結(jié)果判定ERα蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核，ERβ蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，MMP-9主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，以出現(xiàn)棕黃色顆粒染色為陽(yáng)性。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占面積兩者積分之和對(duì)組織切片中各點(diǎn)評(píng)分。染色強(qiáng)度定性積分：不著色為0，淺黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3；染色面積定量積分：無(wú)著色或<5%為0，5%～<24%為1，25%～<50%為2，≥50%為3；兩種積分相加為該點(diǎn)得分。兩項(xiàng)得分相加為總積分，依照0為-，1～2為+，3～4為++，5～6為+++，進(jìn)行半定量判斷；>2(++和+++)為陽(yáng)性，≤2(-和+)為陰性進(jìn)行定性判斷。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料用例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)性研究。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1ERα、ERβ和MMP-9在PTC組織及NTG組織中的表達(dá)ERα陽(yáng)性著色位于細(xì)胞核(圖1)，ERβ陽(yáng)性著色位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)(圖2)，MMP9陽(yáng)性著色位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜(圖3)。

在PTC及NTG組織中，ERα的陽(yáng)性表達(dá)率分別為56.00%(112/200)和8.00%(8/100)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；ERβ的陽(yáng)性表達(dá)率分別為70.00%(140/200)和 58.00%(58/100)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)率分別為82.00%(164/200)和65.00%(65/100)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 PTC和NTG組織中ERα、ERβ和MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)率的比較/例(%)

注：ERα為雌激素受體α、ERβ為雌激素受體β、MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶-9、PTC為人甲狀腺乳頭狀癌、NTG為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫

2.2在PTC中ERα、ERβ和MMP-9的表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系在PTC中，ERα蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率與患者的性別有關(guān)，其在女性患者中的表達(dá)明顯高于男性患者(P<0.01)。MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤的包膜侵犯有關(guān)，在已侵犯腫瘤包膜的腫瘤中的表達(dá)高于無(wú)包膜侵犯的腫瘤(P<0.01)。MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)率與是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)陽(yáng)性率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組 (P<0.05)。MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)率還與TNM分期有關(guān)，隨著TNM分期的進(jìn)展呈上升趨勢(shì)，在Ⅰ和Ⅱ期中的表達(dá)陽(yáng)性率低于Ⅲ和Ⅳ期(P<0.05)。ERα蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤大小、包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期無(wú)關(guān)(P>0.05)。ERβ蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率與患者性別、腫瘤大小、包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期無(wú)關(guān)(P>0.05)。MMP9的陽(yáng)性表達(dá)率與患者性別和腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05)。見表2。

2.3在PTC中ERα、ERβ和MMP-9之間的相關(guān)關(guān)系Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，在PTC組織中，ERα蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率和MMP-9蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.573，P<0.01)，ERβ蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率和MMP-9蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.520，P<0.01)。

3 討論

雌激素受體在甲狀腺組織中的表達(dá)首次報(bào)道于1981年，Molteni等[4]通過使用符號(hào)定向圖(SDG)法證實(shí)甲狀腺乳頭狀癌組織中有雌激素受體表達(dá)。目前國(guó)內(nèi)外研究對(duì)于PTC和NTG組織中ERα和ERβ的表達(dá)仍有爭(zhēng)議，有大量的證據(jù)表明PTC和NTG組織中存在ERα和ERβ的表達(dá)，但仍有個(gè)別研究在PTC和NTG中未檢測(cè)到ERα和ERβ的表達(dá)[5]。

這種爭(zhēng)議可能是因?yàn)榇萍に厥荏w的亞細(xì)胞定位判斷的不同引起的，另外則是采用不同的實(shí)驗(yàn)方法、技術(shù)及統(tǒng)計(jì)方法等因素造成的。本研究中運(yùn)用免疫組化的方法，結(jié)果顯示在PTC和NTG中，ERα表達(dá)于細(xì)胞核，而ERβ則表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。

有研究顯示ERα與ERβ對(duì)細(xì)胞的生存和增殖有相反的作用，ERα具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的作用，而ERβ卻顯示了在分化和促進(jìn)細(xì)胞凋亡中的作用[6]。本研究中ERα在PTC中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其在NTG中的表達(dá)，與 Chen等[6]研究一致。這進(jìn)一步表明在PTC中，ERα是一個(gè)重要的細(xì)胞增殖指標(biāo)，它的高表達(dá)刺激了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。本研究中ERβ在PTC中的表達(dá)高于其在NTG中的表達(dá)，與Chen等[6]研究結(jié)果不同，這可能是因?yàn)镋Rβ亞細(xì)胞定位的不同所引起，Chen等[6]對(duì)ERβ的結(jié)論是基于其在細(xì)胞核的表達(dá)，而本研究中其主要在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)同時(shí)表達(dá)。在浸潤(rùn)性食管癌中ERβ在細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)明顯高于在非浸潤(rùn)性食管癌；在乳腺癌中，ERβ細(xì)胞核的高表達(dá)時(shí)，其內(nèi)分泌治療有效，預(yù)后相對(duì)較好[7]。因此推測(cè)ERβ在不同部位的表達(dá)其作用是不同的。

表2 PTC中ERα、ERβ和MMP-9的表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系

注：ERα為雌激素受體α、ERβ為雌激素受體β、MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶-9、PTC為人甲狀腺乳頭狀癌

PTC存在明顯性別差異，本研究顯示ERα在女性中的表達(dá)明顯高于男性。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可以促進(jìn)人甲狀腺癌乳頭狀細(xì)胞株(BCPAP)和正常甲狀腺細(xì)胞株生長(zhǎng)，并且雌激素能夠促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的粘連、侵襲和轉(zhuǎn)移。但是本研究PTC中ERα和ERβ的表達(dá)與PTC患者的腫瘤大小、包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況及TNM分期無(wú)關(guān)，與Huang 等[9]報(bào)道結(jié)論相一致，推測(cè)ERα和ERβ僅僅參與了雌激素促進(jìn)PTC發(fā)生的過程中，而沒有或很少參與其進(jìn)展。

腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一是細(xì)胞外基質(zhì)的降解，MMP-9是重要的細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，能通過促進(jìn)血管生成和降解細(xì)胞外基質(zhì)，使腫瘤發(fā)生浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移[3]。在本研究中，MMP-9蛋白在PTC中高表達(dá)，且在已侵犯腫瘤包膜的腫瘤中的表達(dá)高于無(wú)包膜侵犯的腫瘤，在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)陽(yáng)性率高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，隨著TNM分期的進(jìn)展呈上升趨勢(shì)，在Ⅰ和Ⅱ期中的表達(dá)陽(yáng)性率低于Ⅲ和Ⅳ期。有研究證實(shí)，在雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞中，ERα表達(dá)水平與MMP-9呈正相關(guān)[10]； 有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ER激動(dòng)劑能夠通過ERα依賴通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，通過ERβ抑制其轉(zhuǎn)移[11]。本研究結(jié)果中MMP-9與ERα蛋白的陽(yáng)性表達(dá)呈顯著正相關(guān)，與ERβ蛋白的陽(yáng)性表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。盡管本研究與已有的文獻(xiàn)報(bào)道的發(fā)生部位不同，但相應(yīng)地可以因此推測(cè)，ERα和ERβ在PTC腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制類似于卵巢癌。當(dāng)然具體的通路還需要進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果證實(shí)，在PTC中，ERα對(duì)PTC的發(fā)生發(fā)展有重要的促進(jìn)作用，ERβ的亞細(xì)胞定位對(duì)其在PTC中所起的作用非常重要，而這兩者與MMP-9之間存在著緊密的聯(lián)系，或許可以為PTC的個(gè)體化治療提供新的線索。

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