葛根素與人血漿蛋白結合率研究

劉夏雯

（廣州醫科大學藥學院 廣東 廣州 511436）

1.前言

葛根素在臨床上常用于高血壓、冠心病和心血管疾病的治療。目前對這類異黃酮化合物的臨床新應用及新機制探討是研究熱點[1，2]。然而，這類化合物的生物利用度很低。已發現造成低生物利用度的原因包括首過代謝和吸收[3]。然而藥物被吸收后，進入血液循環，其中一部分與血漿蛋白結合，另一部分以游離態通過毛細血管壁到達各個靶點，發揮藥效。當游離態藥物分布至組織或被代謝清除后，部分結合藥物又從血漿蛋白重新游離出來。藥物與血漿蛋白的可逆性結合對藥物的生物利用度發揮了巨大的影響。然而葛根素與血漿蛋白結合率研究尚未報道。

因此，本研究對葛根素與人血漿蛋白結合進行研究。利用平衡透析法對葛根素及人血漿以及人血清白蛋白（HSA）和α1-酸性糖蛋白（AGP）分別進行共孵育。利用液質聯用法對透析膜兩測的葛根素進行分析。研究葛根素的血漿蛋白結合率，并闡明主要結合的蛋白類型。為理解葛根素的低生物利用度提供依據。

2.實驗部分

2.1 材料與試劑

葛根素和鳶尾苷對照品購自美國Sigma公司。人血漿來自于本實驗室志愿者。人血清白蛋白和人酸性糖蛋白購于美國Sigma公司。PBS(0.1M，pH 7.4)購自美國GIBCO公司。色譜級甲醇和乙腈購于美國Fisher。其它試劑為化學純。RED快速平衡透析裝置購于美國Thermo。液質聯用系統為Agilent1260-6460三重四級桿液質聯用系統。

2.2 方法與結果

2.2.1 RED裝置預處理 本試驗所采用的快速平衡透析裝置由便攜式的插入管和48孔PTFE基質的底板組成。使用前，底板在20%乙醇溶液中浸泡10min，然后用去離子水沖洗3次后，室溫晾干。透析室在去離子水中浸泡10min，重復兩次后，在保持膜濕潤的條件下立即使用。

2.2.2 樣品預處理 內標儲備液10μL 20μg/mL置于2mL離心管中，N2吹干后，加入樣品100μL，后加入300μL 甲醇，渦旋混合5分鐘，13，000×g離心5分鐘，取上清，N2吹干，殘渣用200μL流動相復溶，2μL進樣。

2.2.3 RRLC-MS/MS方法及方法驗證

LC-MS/MS方法

分析柱為安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18（1.8μm，2.1×50mm）；流動相為0.01% 冰醋酸溶液：甲醇=20%∶80%，流速0.3mL/min。質譜為ESI離子源，正模式。血漿中葛根素含量通過多反應檢測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式進行測定。葛根素選擇離子對為m/z 417/399，內標鳶尾苷離子對為m/z 463/301。

方法驗證

方法驗證參考中國藥典9012指導原則。主要驗證參數為：專屬性，回收率，線性，準確度，精密度，攜帶效應，基質效應及穩定性。

2.2.4 藥物與蛋白結合數學模型及數據處理 利用Scatchard方程，以指結合藥物濃度CB為X軸，結合和游離藥物濃度比值CB/CU為Y軸，由非線性最小二乘法估計得出Y軸上的截距，即nKa，從而得到藥物的結合常數。藥物與蛋白結合率按B=(1-CU/CB)×100%計算；

2.2.5 葛根素與人血漿蛋白，HAS和AGP結合反應 分別配制HAS和AGP于PBS至終濃度為40mg/mL和1mg/mL，取空白人血漿，加入葛根素使其終濃度為0.2、1、5、10、15mM。取200μL含藥血漿加入樣品室，取350μL PBS加入緩沖液室，于37℃孵育4h。樣品室和緩沖液室分別吸取100μL和250μL，按照“樣品預處理”項下方法操作，由LC-MS檢測血漿樣品藥物總濃度(CB)，緩沖液樣品Z中游離藥物濃度(CU)。

葛根素與人血漿蛋白，HAS和AGP在考察濃度范圍內（0.2～15μM）結合率分別高于99%，99%和97%。在低濃度范圍呈現濃度依賴性，隨著藥物濃度的增大，結合率升高，當濃度達到1～5μM后，結合率趨于飽和（見圖1）。

圖1 人血漿白蛋白和酸性糖蛋白中游離葛根素比例。數據表示為平均值和標準誤差，n=3。

葛根素與HAS和AGP結合的擬合曲線說明游離藥物濃度和結合藥物數值都有良好的相關性，r2(+)=0.9799，r2(-)=0.9847，提示了葛根素與HAS和AGP的結合類型可能均屬于一類位點的不飽和結合。結合常數分別為3.5×107M-1和1.5×107M-1。

3.討論

結果表明高血漿蛋白結合率限制了葛根素進入靶組織，造成其低生物利用度。另外，葛根素與AGP和HSA都高度結合，提示了葛根素與人血漿的高結合率來源于與HSA和AGP的共同作用。

[1]張玲，王洪新，齊志敏，孫媛.葛根素對大鼠心肌肥厚的相關細胞因子的影響[J].中成藥，2007，29(7):960-963.

[2] Chengfeng Luo,Mu Yuan,Minsheng Chen.Metabolites of puerarin identified by liquid chromatography tandem mass spectrometry：Similar metabolic profiles in liver and intestine of rats.Jounarl of Chromatography B,2010, 878,363-370.