阿司匹林腸溶片2015年藥典微生物限度檢查法的建立及方法學驗證

（云南省藥物研究所 云南 昆明 650111)

杜春華 李東嫻 和東陽 普冰清 牛延菲 游燕（通訊作者）

阿司匹林，主要成分為2-（乙酰氧基）苯甲酸，最早用于解熱、鎮痛、抗炎，在臨床上，能夠對于感冒發熱、頭痛牙痛以及關節風濕疾病等患者起到較好的鎮痛效果，類別為：解熱鎮痛、非甾體抗炎藥、抗血小板聚集藥[1]-[4]。根據2015版藥典要求，為了確認所采用的方法適合用于某制劑的微生物限度檢查，必須對相應檢驗方法進行方法學驗證。李秋菲等[5]按照中國藥典2005年版一部對阿司匹林緩釋片的微生物限度建立并驗證了檢查方法，發現其具有很強的抑菌作用，現在筆者通過2015年新版藥典建立阿司匹林腸溶片微生物限度檢查方法及方法驗證。

1.儀器與材料

1.1 儀器

隔水式電熱恒溫培養箱（型號：GSP-9160MBE，上海博迅實業有限公司），生化培養箱（型號：LRH-150，上海一恒科學儀器有限公司），勻漿儀（型號：JT-C，漯河海德實驗設備有限公司），二級生物安全柜（型號：BSC-1100ⅡB2-X，濟南鑫貝西生物技術有限公司）

1.2 試藥

1.2.1 供試品 阿司匹林腸溶片。

1.2.2 培養基

胰酪大豆胨液體培養基，批號170310；胰酪大豆胨瓊脂培養基，批號1706282；沙氏葡萄糖瓊脂培養基，批號170608；沙氏葡萄糖液體培養基，批號3106032；

麥康凱瓊脂培養基，批號160303；麥康凱瓊液體培養基，批號161228；pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，批號1705184。（沙氏葡萄糖液體培養基來源于廣東環凱微生物科技有限公司，其余培養基均來源于北京三藥科技開發公司。）

1.2.3 pH試紙 pH精密試紙（6.4-8.0）、pH廣泛試紙（1-14）均購于上海三愛思試劑有限公司。

表1 需氧菌總數計數方法學驗證結果

表2 霉菌和酵母菌總數計數方法學驗證結果

1.3 試驗菌株

銅綠假單胞菌［CMCC(B)10104］、金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501］、黑曲霉［CMCC(F)98003］、白色念珠菌［CMCC(F)98001］，上述5種菌種都來源于中國食品藥品檢定研究院。

2.方法與結果

阿司匹林腸溶片按《中國藥典》2015版規定，需檢查需氧菌總數，霉菌和酵母菌總數，控制菌檢查大腸埃希菌。

2.1 菌液制備

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的的制備參照新版藥典通則1105。制成每1ml含菌數小于100cfu的菌懸液。

2.2 供試液制備

取供試品10g，放入已滅菌的勻漿杯中，加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液50ml，勻漿至供試品均勻分散，用30%碳酸鈉溶液，廣泛和精密pH試紙調節供試品溶液pH至6.7，然后加緩沖液補足至100mL，即得1∶10的供試液。再逐級稀釋為1∶20供試液。

3.方法適用性試驗

3.1 需氧菌總數計數方法適用性試驗

試驗組：取1∶20供試液9.9ml于滅菌試管中，加入制備好的5種陽性菌液0.1ml，使其終濃度為每1ml含菌落數小于100cfu的菌液，從試管中吸取1ml注入滅菌平皿中，立刻傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基，待其凝固后，倒置于恒溫培養箱中30～35℃培養48h。每個菌種平行制備2個平皿，測定試驗組的菌落數。

供試品對照組：取1∶20供試液9.9ml于滅菌試管中，加緩沖液0.1ml，后續操作同試驗組。

菌液對照組：取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9ml于滅菌試管中，加入制備好的5種陽性菌液0.1ml，其余按試驗組操作。

中和劑組：取30%碳酸鈉稀釋劑1ml，平行制備2個平皿，倒入胰酪大豆胨瓊脂培養基混勻。

中和劑對照組：取30%碳酸鈉稀釋劑溶液9.9ml，加入試驗菌懸液0.1ml，搖勻，其余按試驗組操作。

陰性對照組：取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液1ml至平皿中，平行制備2個平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基。

計數方法適用性試驗中，試驗組菌落數-供試品對照組菌落數/菌液對照組菌落數的比值應在0.5～2范圍內；中和劑對照組的菌落數與菌液對照組的菌落數的比值應在0.5～2范圍內，結果見表1。

3.2 霉菌和酵母菌總數計數方法適用性試驗

取1∶10供試液9.9ml于滅菌試管中，加入制備好的白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1ml，其余操作同需氧菌總數計數方法適用性試驗，培養基為沙氏葡萄糖瓊脂，培養溫度20～25℃，培養時間為72h，結果見表2。

3.3 控制菌檢查方法的驗證

試驗組：取調過pH值的1∶10的供試液10mL至100mL胰酪大豆胨液體培養基中，再加入小于100cfu 的大腸埃希菌 1mL，其余操作和結果判斷按2015版藥典通則1106進行。陰性對照組：取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 1mL 按大腸埃希菌檢查法操作。試驗組應檢出大腸埃希菌，陰性對照組不得檢出。試驗結果表明，大腸埃希菌檢查可采用常規法。

4.討論

新版藥典要求將試驗菌加入供試液中，進行挑戰試驗，從而更加客觀地考察了微生物在整個試驗過程中所受的影響[6]。本研究采用30%碳酸鈉溶液調節供試液的pH值呈中性后，取試驗要求濃度的供試液9.9ml于滅菌試管中，加入制備好的試驗菌菌液0.1ml，使其終濃度為每1ml含菌落數小于100cfu的菌液進行后續試驗，通過三次驗證的試驗結果表明，藥典規定驗證用5種試驗菌株的比值均在0.5～2范圍內，阿司匹林腸溶片微生物限度檢查可依據上述試驗方法進行。

《中國藥典》2015年版提出[7]，若試驗中使用了中和劑，那么應設立中和劑對照組，以此來確認所使用的中和劑不影響污染微生物的生長。本研究中采用了30%碳酸鈉溶液作為中和劑，用于調節其pH值，可以消除供試品的抑菌性。筆者在做試驗設計時，做了中和劑組和中和劑對照組，且二者的菌落數比值在0.5～2之間，說明30%碳酸鈉稀釋劑不影響污染微生物的生長。

[1] CHAN T-A,MORIN P J,VOGELSTEIN B,et al. Mechanisms underlying nonsteroidal antiinflammatory drug-mediated apoptosis[J].Proc Natl Acad Sci US A,1998, 95(2):681-686.

[2]李才正，苗佳.阿司匹林的臨床應用進展[J].華西醫學，2012，27（7）:988-991.

[3]許桂萍，馬熱也木·克日木.阿司匹林的藥理特性及其臨床應用[J].中國農村衛生2015(14):28-29.

[4]國家藥典委員會.中國藥典[S].二部.北京：中國醫藥科技出版社，2015:545.

[5]李秋菲，周志云，羅世書.阿司匹林緩釋片微生物限度檢查方法驗證[J].安徽醫藥，2008，12(12):1240-1241.

[6]徐曉潔，冷佳蔚，王志宏，丁勃.具有抗菌活性的中藥固體制劑微生物限度檢查計數方法研究[J].中國藥事，2015，29（9）:946-950.

[7]國家藥典委員會.中國藥典[S].四部.北京：中國醫藥科技出版社，2015:142.