葒草花中五種成分在Caco-2細胞中的吸收特性研究

陳 浩,覃小麗,夏 濤,李月婷,鞏仔鵬,李勇軍,3,鄭 林

(貴州醫科大學1. 貴州省藥物制劑重點實驗室/藥用植物功效與利用國家重點實驗室、2.民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心、3. 藥學院，貴州 貴陽 550004)

葒草花為蓼科葒草PolygonumorientaleL.的干燥花序，又名狗尾巴花、水葒花、何草花等，以其全株收載于2003版《貴州省中藥、民族藥質量標準》[1]，具有行氣消積、活血、止痛的功效，用于腹中痞積、頭痛、心胃氣痛等疾病的治療[2]。課題組前期對葒草各部位藥理篩選實驗中發現，葒草花比其“全草”具有更為明顯的抗心肌缺血作用，為葒草的主要藥效部位[3]。目前，已從葒草花活性部位中提取并鑒定了槲皮素、山奈酚、槲皮苷、山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山柰素-3-O-α-L-鼠李糖苷5種成分[4]。在對葒草花進行藥動學研究發現，如槲皮苷、山柰素-3-O-α-L-鼠李糖苷的絕對生物利用度低[5]，限制其口服給藥后藥效的發揮。而關于葒草花提取物吸收特性尚未見報道。因此，研究其口服吸收機制及影響因素，為葒草花提取物的口服制劑研發和臨床應用具有重要意義。在口服藥物吸收特性的體外研究中，人結腸腺癌細胞系(Caco-2細胞系)已成為經典的細胞模型，具有類似于腸上皮細胞的特征，在形態學和生物化學方面與腸上皮細胞具有相似性。該模型重現性好，與腸道的吸收機制具有良好的相關性，常作為藥物腸吸收和轉運特征研究的體外模型[6-8]。因此，本實驗利用Caco-2細胞模型作為一種中藥吸收研究的篩選工具，并采用UPLC-MS/MS建立葒草花提取物中5個成分的分析方法，測定葒草花提取物在時間、濃度、溫度、pH和P-gp抑制劑條件下對Caco-2細胞的吸收攝取影響，以闡明葒草花5種提取物的吸收機制，為初步評價葒草花提取物的體內吸收特性和葒草花提取物的口服制劑研發及臨床應用奠定科學依據。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑槲皮苷對照品(批號150702)、山奈酚對照品(批號150328)、槲皮素對照品(批號151222)，均購自四川維克奇生物科技有限公司；葒草花有效組分(自制，批號 20150915)；葒草花藥材購自貴州貴陽鹿沖關貴州省藥用植物園種植基地，由貴州醫科大學藥學院生藥學教研室龍慶德副教授鑒定；葛根素 (批號110752-201514)購自中國食品藥品檢定研究院；山奈素-3-O-β-D-葡萄糖苷對照品、山奈素-3-O-α-L-鼠李糖苷對照品(自制)。Caco-2(American Type Culture Collection)，30～50代；DMEM、FBS、Trypsin-EDTA均購于Thermo Fisher Scientific；RIPA、鼠尾I型膠原蛋白均購于Aladdin Industrial Corporation；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)和乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)試劑盒均購于南京建成科技有限公司；BCA蛋白測試試劑盒(Solarbio)；熒光素鈉(上海靈錦精細化工有限公司)；MTS(Promega)；甲醇、乙腈和甲酸為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.2儀器Allegra 64R低溫高速離心機(Beckman Coulter)；MTN-2800D氮吹儀(天津奧特塞恩斯儀器有限公司)；超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀(美國Waters公司)；細胞培養箱(Thermo Fisher Scientific)；TS-100F倒置顯微鏡和CCD照相機(Nikon)；超凈工作臺(蘇州凈化設備總廠)；Millicell培養皿和Millicell?-ERS Ⅱ電阻儀(Millipore)。

1.3色譜條件Acquity? Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm) 色譜柱； 0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫，梯度為0～1.0 min：5%～15%，1.0～3.8 min：15%～18%，3.8～4.0 min：18%～90%，4.0～5.0 min，90%～5%[9]進樣體積：2 μL；柱溫：45℃。

1.4質譜條件Waters Acquity TQD 質譜儀；毛細管電離電壓：3 kV；電噴霧離子源(ESI)；多反應離子監測；離子源溫度：120℃；去溶劑N2溫度：350℃，流速650 L·h-1；反吹氣N2流速：50 L·h-1；碰撞氣Ar流速：0.16 mL·min-1，數據分析：MassLynx V4.1工作站。離子對如下：山奈酚m/z(+)287.1→213.2、槲皮素m/z(+)303.2→153.1、槲皮苷m/z(+)449.1→303.2、山奈素-3-O-β-D-葡萄糖苷m/z(+)449.05→287.2、山奈素-3-O-α-L-鼠李糖苷m/z(+)433.1→287.2，葛根素(內標)m/z(-)417.0→267.0；錐孔電壓分別為：45 V、45 V、20 V、25 V、20 V、40 V；碰撞電壓分別為：30 V、40 V、10 V、10 V、10 V、30 V。

1.5標準溶液的制備分別精密稱取槲皮素等5種樣品適量，用甲醇溶解并定容至10 mL。得槲皮素(1.22 g·L-1)、山奈酚(1.13 g·L-1)、槲皮苷(1.1 g·L-1)、山奈素-3-O-β-D-葡萄糖苷 (1.1 g·L-1)、山奈素-3-O-α-L-鼠李糖苷(0.96 g·L-1)標準溶液。分別精密量取槲皮素等5種對照品儲備液適量，37℃氮氣吹干，按梯度稀釋成所需濃度，得混合系列標準溶液。精密稱維拉帕米和環孢菌素A適量，HBSS定容至10 mL，得維拉帕米 (10 g·L-1)，環孢菌素A (5 g·L-1)溶液，置溫度為-20℃冰箱中保存，備用。

1.6細胞裂解液的制備將已培養好的Caco-2用預熱的HBSS液輕輕清洗細胞表面。然后將提取物按設定的組別溶解于HBSS，每孔添加1.5 mL，培養90 min，取出后，添加4℃的HBSS終止攝取，并用HBSS迅速沖洗3遍，加入500 μL RIPA，4℃條件下振蕩，裂解細胞，取出，超聲5 min，混勻，轉移，得細胞混懸液[10]。

1.7樣品前處理取400 μL細胞裂解液和細胞混懸液，再取50 μL內標溶液和2 mL乙酸乙酯加入，渦混3 min，6 000 r·min-1離心，提取上清液2 μL進LC-MS分析。

1.8Caco-2細胞模型的建立將Caco-2細胞株迅速復蘇，接種于T-25斜頸培養瓶中，培養液為高糖DMEM培養基，培養基中含10%胎牛血清、1%雙抗。置于5% CO2、37℃培養箱(相對濕度90%)培養。待培養的細胞90%融合時，用PBS洗凈細胞表面雜質，再用37℃預熱的胰酶-EDTA消化后，接種于6孔培養板， 24 h后更換培養液，以后隔日換液，1周后每天換液，培養14 d后，待細胞生長均勻、邊界清晰，成單層膜狀態，測定細胞跨膜電阻值為300 Ω·cm2以上[9-10]，可用于測定的葒草花提取物中各化合物在Caco-2細胞中的攝取特點。

1.9Caco-2細胞攝取實驗

1.9.1不同濃度葒草花提取物對細胞的毒性 將實驗分為空白對照組和藥物組，空白對照組添加100 μL的無血清DMEM；藥物組用無血清DMEM將受試化合物配制成0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 g·L-1的稀釋液，每孔添加100 μL藥液，置于95% O2、37℃培養箱中培養4 h后，用MTT法進行檢測。每個濃度平行5孔，實驗重復3次。考察不同濃度葒草花提取物對細胞的毒性。

1.9.2濃度依賴性攝取實驗 取不同濃度(0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 g·L-1)的葒草花提取物的HBSS溶液2 mL(n=3)，置于Caco-2細胞中，在37℃下培養1 h，考察不同葒草花提取物濃度對細胞攝取的影響。

1.9.3時間依賴性攝取實驗 將2 g·L-1葒草花提取物加入到培養好的細胞中，考察在不同攝取時間(30、60、90、120、180 min)條件下，葒草花提取物被Caco-2細胞攝取的變化。

1.9.4不同pH對葒草花提取物攝取的影響 將2 g·L-1葒草花提取物分別溶于不同pH(5.0、6.0、7.4)的HBSS緩沖液中，測定在加藥90 min后不同pH值條件下，Caco-2細胞攝取的變化。

1.9.5不同溫度對葒草花提取物攝取的影響 將2 g·L-1葒草花提取物溶于HBSS緩沖液中，于不同溫度(4℃、25℃、37℃)條件下培養，在加藥90 min后，分別測定在不同溫度條件下，Caco-2細胞攝取的變化。

1.9.6P-gp對葒草花提取物攝取的影響 分別加入含環孢菌素A (10 mg·L-1)的葒草花提取物(2 g·L-1)溶液，維拉帕米 (50 mg·L-1)的葒草花提取物(2 g·L-1)溶液，分別于給藥90 min后，測定有無抑制劑時，Caco-2細胞對葒草花提取物攝取的影響。

2 結果

2.1UPLCMS/MS分析方法的確證分別取空白細胞混懸液、混合標準溶液(內標為葛根素)以及進行攝取實驗的細胞樣品溶液，渦旋2 min，15 000 r·min-1離心10 min，分離上清液進樣分析。實驗表明，空白細胞混懸液中無雜質峰干擾，細胞混懸液中槲皮素等5種成分及內標葛根素分離完全，保留時間(Rt)分別為1.35、3.82、3.98、2.30、2.27、2.91 min。結果見Fig 1，圖中以時間為橫坐標，百分強度為縱坐標。

以樣品與內標的峰面積比和混合溶液中的藥物濃度分別為縱坐標和橫坐標，得到葒草花5種成分的工作曲線，其線性范圍、回歸方程如Tab 1所示。槲皮素等5種成分攝取轉運實驗標準曲線方程分別見Tab 1。各成分在0.05～72 mg·L-1范圍線性關系良好 (r≥0.999 )。

根據“標準曲線”項，分別配制高，中，低3個濃度的山奈酚等5種成分的溶液作為質量控制樣品，在所確定的質譜條件下分析，將測定的濃度與加入已知標液濃度濃度比較，求得回收率均大于90%，每個濃度再分別配制5份進行樣本分析，連續測定3 d，日內精密度RSD%為1.12%～4.74%，日間精密度RSD%為1.14%～4.53%。

將上述質控樣品，放置于室溫，分別于1、2、3 d后取樣處理分析，根據槲皮素等5種成分的色譜峰面積計算其RSD%，結果槲皮素等5種成分與零時比較，RSD值均小于3%。上述結果表明，此方法穩定、靈敏，重現性好。

2.2Caco-2細胞攝取實驗

2.2.1不同濃度葒草花提取物對細胞的毒性 如Fig 2所示，各給藥組在所設計的濃度范圍內，隨著濃度的增加，葒草花提取物對Caco-2細胞生長無毒性作用，可以進行下一步攝取實驗。

Tab 1 The mean values of regression equation of the analytes

Fig 1 UPLC-MS/MS chromatogram of all compounds in uptake test

A: Blank solution; B: Blank solution spiked with standands; C: Real sample. 1: Puerarin; 2: Quercetin; 3: Kaempferol; 4: Quercetin-3-rhamnoside; 5: Kaempferide-3-O-β-D-lglucoside; 6: Kaempferide-3-O-α-L-rhamnoside

Tab 2 Effect of different pH of compounds on Caco-2 cell

*P<0.05,**P<0.01vspH=6

Fig 2 Effect of Polygonum orientale L. Flower extracton cytotoxicity of Caco-2 cells(n=5)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.2.2濃度依賴性攝取實驗 如Fig 3所示，槲皮素等5個成分的攝取量隨濃度的增加而增加，表明葒草花中5個成分的攝取方式主要表現為被動擴散。

Fig 3 Effect of different concentrations of Polygonum orientale L.

2.2.3時間依賴性攝取實驗 Fig 4結果表明，槲皮素等5個成分的攝取量隨時間的增加而降低，可能原因為中藥成分復雜，各成分之間的吸收可能相互影響，也可能由于酶的水解和轉運體的影響，導致槲皮素等5個成分的攝取量隨時間的增加而降低。綜合考慮，選擇90 min作為最佳攝取時間來進行后續實驗。

Fig 4 Effect of different time of Polygonum orientale L.

2.2.4不同pH對葒草花提取物攝取的影響 Tab 2結果表明，槲皮素等5個成分在pH 7.4和pH 5時吸收特性與pH 6時差異有顯著性。除槲皮素外，其余4種成分在pH 6.0時，吸收大于pH 7.4和pH 5，差異具有顯著性；槲皮素在pH 5時，吸收明顯大于pH 6.0，可能原因為其本身為弱酸性化合物，在酸性條件下更易被吸收。

2.2.5不同溫度對葒草花提取物攝取的影響 Fig 5結果表明，槲皮素等5種成分在37℃的條件下，攝取量均大于4℃和25℃，并且攝取量隨溫度的增加而增加。

2.2.6P-gp對葒草花提取物攝取的影響 在以上實驗所確定的pH為6，溫度為37℃的攝取條件下進行實驗，Tab 3結果表明，在合并維拉帕米或環孢菌素A條件下，葒草花中槲皮素和山奈酚攝取量明顯增加，表明槲皮素和山奈酚可能是P-gp的底物。

Tab 3 Effect of P-glycoprotein inhibitors on compound uptake in Caco-2

*P<0.05,**P<0.01vsPolygonumorientaleL. Flower extract from control group

Fig 5 Effect of different temperature of Polygonum orientale L.

其余各成分的攝取不受抑制劑的影響。

3 討論

Caco-2細胞模型具有較高的重現性，兼具快速、易于控制、干擾小、可連續檢測和接近藥物在人體內吸收的實際環境等優點，成為預測藥物體內吸收、闡明藥物吸收機制的良好工具，被國內外廣泛用于藥物吸收特性研究[11]。

研究表明，在0.2～5.0 g·L-1濃度范圍內，細胞攝取表現為一級速率過程，表明其攝取方式主要為被動擴散。但攝取量隨時間的增加而降低，提示藥物在進入細胞后可能受到酶的水解和轉運體的影響，導致其轉運過程中攝取量隨時間的增加而降低，在葒草花提取物的5種代表性成分中，除槲皮素和山奈酚外，其余都為苷類化合物，而苷類藥物進入細胞后容易被水解。同時，由于受到轉運體的外排作用，是導致攝取量隨時間的增加而降低的可能原因。在維拉帕米參與的條件下，槲皮素和山奈酚攝取量明顯增加，也進一步證實槲皮素和山奈酚的吸收受到P-gp的外排作用，降低了藥物的吸收。

同時，胃腸道內的pH環境影響藥物在體內的溶解性和吸收情況。實驗結果表明，當pH為5時，槲皮素的攝取明顯增加，這可能與其化合物本身含有酚羥基酸性基團有關。當化合物呈酸性時，在中性和偏堿性的環境中以電離形式存在，導致其提取物在細胞膜的滲透性降低。且由于溫度對酶影響，使其提取物的細胞攝取量呈溫度依賴性。

本實驗初步闡明了葒草花5種提取物的細胞吸收機制及其影響因素，為其臨床應用及口服制劑的研究開發提供細胞水平的實驗基礎和科學依據。但是，目前運用Caco-2細胞模型研究中藥大多是單一的對中藥化學成分的研究，而中藥含多種成分，且成分復雜，只通過對單一成分的吸收機制來說明其中藥的吸收機制具有片面性，容易忽視成分間的相互影響。所以，運用Caco-2細胞模型對中藥多成分吸收特征及篩選研究，對中藥復雜成分的吸收機制闡明具有參考意義。

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