蟲草素對MPTP誘導的小鼠多巴胺能神經元損傷的保護作用及其機制

樊逸云，唐培宸，顧欣霞，張 鑫，孫 瑩，余伯成，張曉燕，葛曉群

(1. 揚州大學醫學院藥理學教研室，江蘇 揚州 225001；2. 上海國寶企業發展中心，上海 201203)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種中樞神經系統退行性疾病，其主要特征是中腦黑質致密部(substantia nigra pars compacta，SNpc)多巴胺(dopamine，DA)能神經元變性死亡，最終導致DA含量降低[1]。其發病機制十分復雜，與細胞凋亡關系密切[2]。目前，臨床治療的藥物主要緩解患者癥狀，難以從根本上抑制DA能神經元的漸進性丟失[3]，因此，尋找能夠阻止PD病程的神經保護劑意義重大。

蟲草素(cordycepin，Cor)是從蛹蟲草中分離的一種核苷類化合物，具有廣泛的藥理活性，然而，其對PD的影響報道甚少。Olatunji等[4]和本課題組[5-6]前期研究發現，Cor可抑制PD模型PC12細胞的損傷和凋亡。然而，Cor是通過何種信號轉導通路介導了這一效應，以及能否在動物體內發揮對DA能神經元的保護作用，目前尚未見該方面的研究報道。

多條信號轉導通路參與介導了PD黑質DA能神經元的凋亡[7]，其中，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信號轉導通路發揮了重要作用。體外研究發現，激活JNK通路可引起DA神經元凋亡[8]，在PD患者腦組織中亦發現p38通路明顯活化[9]，中腦黑質部有p-ERK1/2的積聚[10]。為此，本研究利用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)制備PD小鼠模型，觀察Cor對中腦黑質DA能神經元及MAPK信號通路的影響，以進一步探討其神經保護作用及機制，為探索PD治療新靶點提供依據，為Cor作為神經保護劑的臨床應用提供實驗基礎。

1 材料

1.1實驗動物50只C57BL/6小鼠，♂，體質量(20±2)g，購于揚州大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證：SCXK(蘇)2012-0004，使用許可證號：SYXK(蘇)2012-0029。小鼠飼養于溫度為(20±2)℃、相對濕度(60±10)% 的動物房，自由進食水，12 h/12 h光照周期。

1.2藥物與試劑蟲草素(純度99%，上海國寶企業發展中心)；MPTP(東京化成工業株式會社)；DA、二羥苯乙酸(DOPAC)和 高香草酸(HVA)標準品(美國Sigma公司)；TUNEL法細胞凋亡檢測試劑盒、HRP標記的二抗(博士德生物工程有限公司)；抗TH、p-p38、p-ERK1/2抗體(美國Abcam公司)；抗JNK1/2和p-JNK1/2抗體(上海生工生物工程有限公司)；抗Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、p38、ERK1/2、GAPDH抗體(萬類生物科技有限公司)；β-actin抗體(北京博奧森生物技術科技有限公司)。

1.3儀器大小鼠轉棒疲勞測試儀、曠場實驗箱、Super Maze+高通量動物行為實驗分析系統(上海欣軟信息科技有限公司)；Nikon80i正置顯微鏡(日本Nikon公司)；Multiskan FC型酶標儀(美國Thermo公司)；5415R型冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Tanon 5200全自動化學發光成像系統(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1實驗分組及給藥50只小鼠，隨機分為5組，每組10只。分別為：正常對照組、模型組(MPTP組)、Cor低、中、高劑量組(2.5、5.0、10.0 mg·kg-1)。Cor用生理鹽水溶解，給藥劑量由預實驗確定，灌胃給藥。MPTP(30 mg·kg-1)溶于生理鹽水，腹腔注射給藥[11]。對照組d 1～15灌胃生理鹽水，d 4～8注射生理鹽水；模型組d 1～15灌胃生理鹽水，d 4～8注射MPTP；Cor組d 1～15分別灌胃不同濃度Cor，d 4～8注射MPTP。末次給藥結束后，d 2進行小鼠行為學檢測。

2.2行為學檢測

2.2.1曠場實驗 實驗前2 h，將小鼠從動物飼養室移至行為學檢測實驗室，讓其適應實驗室環境。實驗開始時，將動物放于50 cm×50 cm × 25 cm的曠場內，讓其自由活動10 min，記錄小鼠的運動軌跡和運動距離。

2.2.2轉棒實驗 小鼠實驗前訓練3 d，疲勞轉棒儀直徑為3 cm，每只小鼠每天訓練300 s。正式實驗時轉速設定300 s內，由4 r·min-1逐漸加速到40 r·min-1，記錄小鼠從轉軸上跌落的潛伏期。每只重復3次，每次間隔30 min，取平均值。

2.2.3爬桿實驗 木桿長50 cm，直徑1 cm，頂端固定有直徑2.5 cm的木球，木桿纏紗布以防打滑，記錄小鼠在球上停留的時間(T1),以及小鼠從小球底端爬到桿的底部所需要的時間(T2)。每只重復3次，每次間隔3 min，取平均值。

2.3HPLC-ECD法檢測紋狀體DA及其代謝產物含量行為學測定結束后，每組取6只小鼠，斷頭取腦，在冰上迅速取出同一側紋狀體稱重，每1 mg組織加10 μL勻漿液，超聲勻漿。于4℃、20 000 r·min-1離心20 min，取上清液，-80℃保存備用。HPLC-ECD檢測紋狀體組織中DA、DOPAC、HVA的含量。

2.4免疫組織化學法檢測TH陽性細胞行為學測定結束后，每組取3只小鼠，麻醉后用4%多聚甲醛心臟灌流，斷頭取腦，放入4%的多聚甲醛中繼續固定，之后常規石蠟包埋。根據小鼠腦立體定位圖譜進行冠狀連續切片，片厚4 μm，切片分組收集。采用免疫組化SABC法，在光鏡下對SNpc區域觀察并拍照，每只小鼠重復觀察3張切片，用Image plus 6.0圖像分析軟件，選擇有清晰細胞輪廓帶有明顯核仁的神經元進行計數，定量分析SNpc區域TH陽性細胞。

2.5TUNEL法檢測細胞凋亡采用TUNEL法，按試劑盒方法操作。光鏡下觀察SNpc區域，每只小鼠重復觀察3張切片，計數每張切片SNpc區5個高倍視野的陽性細胞，每只小鼠3張切片陽性細胞數的平均值為該只小鼠凋亡細胞數。

2.6Westernblot法檢測相關蛋白的表達6只小鼠取出紋狀體后，分離黑質組織，取其中3只小鼠的黑質組織,按比例加入新鮮配制的RIPA裂解液進行勻漿，4℃、10 000 r·min-1離心15 min，收集上清于-80℃保存備用。BCA法進行蛋白含量測定。以30 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉印，封閉，加入一抗(Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、p38、p-p38、ERK 1/2、p-ERK 1/2、JNK 1/2、p-JNK 1/2)4℃過夜。TBST洗膜后，加入二抗4℃孵育4 h，洗膜后用ECL法顯影，使用Image J軟件進行灰度分析。

3 結果

3.1Cor對PD小鼠運動功能的影響

3.1.1曠場實驗 曠場實驗是目前評價小鼠運動功能和精神狀態最常用的方法之一。與對照組相比，模型組小鼠的運動總路程明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，除低劑量外，中、高劑量Cor預處理后，小鼠的運動總路程均明顯增加(P<0.01)，自發活動能力得以改善(Fig 1A)。

3.1.2轉棒實驗 轉棒實驗主要用來觀察小鼠的肌張力和平衡協調能力。與對照組相比，模型組小鼠在滾筒上滯留的時間明顯縮短(P<0.01)，且出現肌肉無力、不喜運動等現象，說明小鼠運動平衡功能受損嚴重；與模型組相比，Cor組小鼠的滯留時間有延長的趨勢，中、高劑量Cor組效果明顯(P<0.01)，一定程度提高了小鼠的肌張力及運動平衡能力(Fig 1B)。

3.1.3爬桿實驗 爬桿實驗是常用的評價MPTP模型小鼠動作遲緩的方法，爬桿動作需要姿勢調整及平衡協調能力的共同參與。模型組小鼠在球上停留的時間(T1)和爬完全桿的時間(T2)均較對照組明顯延長(P<0.01)。與模型組相比，不同劑量Cor干預后，T1均明顯縮短(P<0.01)，T2與T1結果趨勢相似，除Cor低劑量組差異無顯著性，其余組均明顯縮短(P<0.05，P<0.01)，改善了小鼠運動遲緩，提高了身體協調性(Fig 1C)。

Fig 1 Effects of cordycepin on motor functions of

A: The movement distance of mice in the open-field; B: The retention time of mice on the rotating rod; C: Pole test of mice.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsMPTP

3.2Cor對PD小鼠紋狀體DA及其代謝產物含量的影響與對照組比較，模型組小鼠紋狀體內DA含量明顯降低(P<0.01)，其代謝產物DOPAC、HVA含量也出現明顯下降(P<0.01)。與模型組比較，各Cor組小鼠紋狀體內DA、DOPAC、HVA含量均明顯升高(P<0.05，P<0.01)，見Tab 1。

Tab 1 Effects of cordycepin on DA and its metabolitesin striatum of MPTP-induced mice n=6)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsMPTP.

3.3Cor對PD小鼠黑質TH陽性細胞數的影響對照組小鼠SNpc區可見大量排列整齊的TH免疫陽性神經元，細胞飽滿，呈梭形或錐體形，軸突和樹突交織的網狀結構清晰完整。與對照組相比，模型組小鼠SNpc區TH免疫陽性細胞明顯減少(P<0.01)，神經元胞體皺縮，軸突和樹突丟失嚴重；與模型組相比，Cor低、中、高劑量組小鼠SNpc區TH免疫陽性細胞丟失程度均明顯減輕(P<0.01)，其中Cor低劑量組神經元皺縮情況有所改善，但軸突和樹突丟失依然明顯，Cor中、高劑量組神經元胞體較為飽滿，軸突和樹突的網狀結構損傷不明顯，以Cor高劑量組最為清晰完整(Fig 2、Tab 2)。

Tab 2 Effects of cordycepin on TH-immunoreactivecells and TUNEL-immunoreactive cells in SNpc of

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsMPTP

3.4Cor對PD小鼠黑質DA神經元凋亡的影響對照組僅見極少量的TUNEL染色陽性細胞，而模型組可見大量棕黃色TUNEL染色陽性細胞，細胞核皺縮，形態不規則。Cor干預后，各組TUNEL染色陽性細胞較模型組均明顯減少(P<0.01)，見Fig 3、Tab 2。

3.5Cor對凋亡相關蛋白表達的影響如Fig 4所示，與對照組相比，MPTP模型小鼠SN中Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達明顯增加，Bcl-2蛋白表達和Bcl-2/Bax比值明顯降低，且差異均具有顯著性(P<0.01)；Cor干預后可以逆轉上述現象，Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達和Bcl-2/Bax比值均升高，其中Cor中、高劑量組作用明顯(P<0.01)。

Fig 2 Effects of cordycepin on TH-immunoreactive cells in SNpc of MPTP-induced mice (×100)

A: Control group; B: 30 mg·kg-1MPTP group; C: 2.5 mg·kg-1Cor+MPTP group; D: 5.0 mg·kg-1Cor +MPTP group; E: 10.0 mg·kg-1Cor+MPTP group.

Fig 3 Effects of cordycepin on apoptosis in SNpc of MPTP-induced mice (×400)

A: Control group; B: 30 mg·kg-1MPTP group; C: 2.5 mg·kg-1Cor +MPTP group; D: 5.0 mg·kg-1Cor +MPTP group; E: 10.0 mg·kg-1Cor+MPTP group.

3.6Cor對MAPK通路蛋白表達的影響如Fig 5所示，各組間p38、ERK1/2、JNK1/2蛋白表達均無明顯變化。與對照組相比，模型組小鼠黑質中p-p38、p-ERK1/2及p-JNK1/2蛋白表達均明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，除Cor低劑量組p-p38和p-JNK表達無明顯差異外，其他各組p-p38、p-ERK1/2、p-JNK1/2蛋白表達均明顯減少(P<0.05，P<0.01)。

4 討論

PD患者的臨床癥狀以運動功能障礙為主，其原因是中腦SNpc區DA能神經元變性死亡，導致紋狀體DA含量下降所致。本研究應用MPTP成功地模擬了上述變化，并觀察到Cor能改善模型小鼠自主活動減少、運動遲緩和平衡協調能力下降的現象。同時，檢測到小鼠SNpc區TH免疫陽性神經元丟失程度明顯減輕，紋狀體DA、DOPAC、HVA含量明顯升高。有研究發現，爬桿實驗結果與小鼠紋狀體DA濃度高度相關[12]，這在本實驗中也得到證實。上述結果表明Cor能夠抑制MPTP-PD小鼠DA能神經元損傷，顯示了較好的神經保護作用。這一結果目前尚未見文獻報道。

PD的發病與細胞凋亡關系密切。在我們前期的體外實驗中，通過Hoechst 33258核染色、Annexin V-FITC/PI雙染和電鏡實驗發現，Cor可以抑制魚藤酮(rotenone，Rot)誘導的PC12細胞凋亡[5]。本實驗顯示，模型組小鼠黑質區出現大量TUNEL染色陽性細胞，Cor可以明顯減少其陽性細胞數量，提示Cor在體內、體外均可抑制DA能神經元凋亡。細胞凋亡過程受到一系列凋亡蛋白的控制，其中Bcl-2家族和caspase家族最具代表性。Bcl-2家族中抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是細胞凋亡的主要作用蛋白，Bcl-2/Bax比率直接決定了細胞的存亡。caspase-3是caspase家族中最重要的凋亡執行者之一，它的活化能夠啟動凋亡級聯反應。本實驗顯示，Cor可以逆轉MPTP引起的Bcl-2表達降低，Bax表達增加和caspase-3的活化，提高Bcl-2/Bax比值，發揮抗凋亡作用。

在哺乳動物體內，MAPK信號轉導通路參與了細胞增殖、分化、凋亡和應激等病理生理過程，主要包括由p38、ERK、JNK介導的3條途徑。本研究發現，MPTP可以使小鼠黑質中p-p38、p-ERK1/2、p-JNK1/2蛋白表達明顯增加。Cor預處理后抑制了MPTP導致的p38、ERK1/2、JNK1/2蛋白的磷酸化，使其表達明顯減少。既往研究表明，JNK信號通路參與了線粒體介導的細胞凋亡，促進線粒體釋放細胞色素C到胞質，激活caspase級聯反應[8]，誘導DA能神經元凋亡。另一方面，p38活化后能通過Fas受體途徑介導凋亡[13]。我們在Rot誘導的PC12細胞中發現，Cor能夠明顯提高線粒體膜電位，減少細胞色素C向胞質的釋放，并能下調Fas蛋白的表達[13]，推測Cor可能是通過抑制p38和JNK1/2的磷酸化，經內源性和外源性途徑抑制細胞凋亡的。自由基能夠激活ERK1/2，誘發下游細胞信號分子Bax的表達[14]，并且可以啟動caspase-3活化，導致DA能神經元變性丟失[15]。體外研究發現，Cor能提高PD細胞內超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶活性，降低細胞內活性氧和丙二醛水平[4,6]，據此推測Cor可能通過清除自由基，減弱氧化應激反應而抑制ERK1/2的激活，最終減少DA能神經元凋亡。當然，本研究只是初步結果，還有待進一步實驗證實。氧化應激誘導神經細胞凋亡的分子機制十分復雜，其調控途徑還包括NF-κB通路、p53通路、PI3K/Akt通路、Nrf2通路等信號通路，Cor是否參與了這些信號通路的調控，還有待進一步研究。

Fig 4 Effects of cordycepin on protein expressions of apoptosisrelated proteins in SN of MPTP-induced n=3)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsMPTP

Fig 5 Effects of cordycepin on protein expressions ofMAPK signal in SN of MPTP-induced mice n=3)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsMPTP

綜上所述，Cor對MPTP誘導的小鼠DA能神經元損傷具有保護作用，其機制可能是通過抑制MAPK的磷酸化水平，下調Bax表達，上調Bcl-2表達，以及抑制caspase-3活化，最終抑制DA能神經元凋亡。

(致謝：本實驗在揚州大學醫學院大型實驗儀器平臺和藥學實驗中心完成，感謝課題組全體老師和同學給予的指導和幫助，同時也感謝南京醫科大學江蘇省神經退行性疾病重點實驗室為DA含量測定提供的幫助和支持)

[1] Mosley R L, Benner E J, Kadiu I, et al. Neuroinflammation, oxidative stress and the pathogenesis of Parkinson's disease [J].ClinNeurosciRes, 2006,6(5): 261-81.

[2] Hirsch E C, Jenner P, Przedborski S. Pathogenesis of Parkinson's disease [J].MovDisord, 2013,28(1): 24-30.

[3] 袁惠麗, 汪 璇, 張麗娟, 等. 中藥在防治帕金森病中的作用及研究進展 [J]. 中國藥理學通報, 2010,26(7): 850-4.

[3] Yuan H L, Wang X, Zhang L J, et al. Mechanism and research progress of Chinese traditional medicine in the prevention and treatment of Parkinson's disease [J].ChinPhamacolBull, 2010,26(7): 850 - 4.

[4] Olatunji O J, Feng Y, Olatunji O O, et al. Cordycepin protects PC12 cells against 6-hydroxydopamine induced neurotoxicity via its antioxidant properties [J].BiomedPharmacother, 2016,81: 7-14.

[5] 陳 琴, 姜 新, 顧欣霞, 等. 蟲草素對魚藤酮誘導PC12細胞凋亡的保護作用 [J]. 中國新藥雜志, 2016,25(8): 938 - 43.

[5] Chen Q, Jiang X, Gu X X, et al. Protective effect of cordycepin against PC12 cell apoptosis induced by rotenone [J].ChinJNewDrugs, 2016,25(8): 938 - 43.

[6] 姜 新, 張 鑫, 顧欣霞, 等. 蟲草素抑制帕金森病細胞凋亡的caspase激活途徑研究 [J]. 沈陽藥科大學學報, 2017,34(10): 899 - 904.

[6] Jiang X, Zhang X, Gu X X, et al. Caspase activation pathway related to the anti-apoptosis effects on PD cells by cordycepin [J].JShenyangPharmUniv, 2017,34(10): 899 - 904.

[7] 徐圓圓, 梁小鳳, 朱雯婷, 等. 5-羥基-1-氫-吲唑對SH-SY5Y細胞的保護作用及其機制研究 [J]. 中國藥理學通報, 2016,32(3):378 - 84.

[7] Xu Y Y, Liang X F, Zhu W T, et al. The protective action and its mechanism of 5-hydroxy-1H-indazole in SH-SY5Y cells [J].ChinPhamacolBull, 2016,32(3):378 - 84.

[8] Huang Q, Du X, He X, et al. JNK-mediated activation of ATF2 contributes todopaminergic neurodegeneration in the MPTP mousemodel of Parkinson’s disease [J].ExpNeurol, 2016,277: 296-304.

[9] Corti O, Hampe C, Koutnikova H, et al. The p38 subunit of the aminoacyl-tRNA synthetase complex is a Parkin substrate: linking protein biosynthesis and neurodegeneration [J].HumMolGenet, 2003,12(12):1427-37.

[10] Zhu J H, Kulich S M, Oury T D, Chu C T. Cytoplasmic aggregates of phosphorylated extracellular signal regulated protein kinases in Lewy body diseases [J].AmJPathol, 2002,161(6):2087-98.

[11] 劉樹民, 張 琳, 叢樹園, 于海龍. MPTP對小鼠帕金森病造模條件探討 [J]. 中國實驗動物學報, 2007,15(2): 146- 50.

[11] Liu S M, Zhang L, Cong S Y, Yu H L. Exploration on the conditions of establishment of MPTP-Induced mouce model of Parkinson’s disease [J].ActaLabAnimSciSin, 2007,15(2):146-50.

[12] Matsuura K, Kabuto H, Makino H, Ogawa N. Pole test is a useful method for evaluating the mouse movement disorder caused by striatal dopamine depletion [J].JNeurosciMethods, 1997,73(1):45-8.

[13] 王 茜, 張 輝, 張作鳳, 等. p38MAPK對帕金森病MPTP模型小鼠NF-κB和COX-2調控的研究 [J]. 中國現代醫學雜志, 2012,22(28):15-20.

[13] Wang Q, Zhang H, Zhang Z F, et al. Role of p38 MAPK in regulating expression of NF-κB and COX-2 in substantia-nigra of MPTP Parkinson's disease mice model [J].ChinJModMed, 2012,22(28): 15-20.

[14] Sawe N, Steinberg G, Zhao H. Dual roles of the MAPK/ERK1/2 cell signaling pathway after stroke [J].JNeurosciRes, 2008,86(8):1659-69.

[15] 石 沖, 張國彬, 張宇新, 張作鳳. 磷酸化ERK1/2對帕金森病模型小鼠黑質半胱氨酸蛋白酶-3表達的影響 [J]. 中國老年學雜志, 2015,35(24): 7046 - 8.

[15] Shi C, Zhang G B, Zhang Y X, Zhang Z F. Effect of p-ERK1/2 on the expression of caspase-3 in Parkinson's disease mice model [J].ChinJGerontol, 2015,35(24): 7046-8.