殼聚糖包覆姜黃素脂質體體外釋放和藥代動力學研究

李 嫄，趙 靜，余忠姝，曾 梅，張景勍

(重慶醫科大學藥學院重慶高校藥物工程研究中心，重慶 400016)

多年生草本姜黃素(curcumine, CM)是一種從姜黃根莖中提取的酚類活性物質，廣泛種植于熱帶南亞和東南亞國家[1]。許多研究表明其毒性低，在抗腫瘤方面的潛力巨大[2]。CM對所有類型的肺癌細胞具有細胞毒性作用，如非小細胞肺癌A549和H1975細胞、大細胞肺癌H460細胞、肺鱗狀細胞癌Calu-1細胞、小細胞肺癌H446和H187[3]。然而，水溶性差和快速降解引起生物利用度低，因此，提高CM的生物利用度對臨床應用具有重要意義[4]。脂質體是由磷脂雙分子層形成的、內部包含藥物的封閉囊泡，具有緩釋、靶向性、組織相容等優點。殼聚糖為天然高分子多糖，具有良好的生物相容性、可降解性和黏附性[5-6]，可用于脂質體的包衣，以增加脂質體的穩定性和靶向性。近年來，殼聚糖在醫藥領域中的應用不僅包括止血、抗菌、人造組織器官等研究，還被廣泛用作藥物載體材料[7-8]。本文初步考察了殼聚糖包衣姜黃素脂質體(chitosan coated curcumin liposomes, CMLP-CS)的體外釋藥特征及大鼠體內的藥代動力學行為，以期促進CM吸收，提高其生物利用度，并為進一步研究CMLP-CS口服給藥奠定基礎。

1 材料

1.1藥物與試劑CM(規格：10 mg，西安帥諾生物科技有限公司)；蛋黃卵磷脂(規格：500 mg，國藥集團化學試劑有限公司)；膽固醇(規格：500 mg，國藥集團化學試劑有限公司)；尼群地平(純度>99%，國藥集團化學試劑有限公司)；殼聚糖(脫乙酰度95%，規格1 g，浙江金殼生物化學有限公司)；乙腈、乙醇等均為色譜純，實驗用水均為超純水。

1.2儀器LC-2010AHT高效液相色譜儀(日本島津公司)；T-6新世紀紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；Nano-ZS90型馬爾文粒徑測定儀(英國馬爾文公司)。

1.3實驗動物12只SD健康大鼠，♂，體質量(230±20)g，動物使用許可證號：SYXK(渝)2015-0001，重慶醫科大學動物實驗中心提供。

2 方法

2.1CMLP-CS的制備采用薄膜分散法制備姜黃素脂質體[9]。稱取處方量的磷脂、膽固醇和姜黃素于梨形瓶中，用無水乙醇超聲溶解后，旋轉蒸發揮去乙醇，在瓶壁形成均勻類脂薄膜。再加入適量磷酸鹽緩沖液 (pH 6.8 PBS)，45℃旋轉水合60 min使膜溶解，探頭超聲5 min，即得姜黃素脂質體。將得到的上述脂質體初懸液10 mL，緩慢滴加到一定體積的2 g·L-1CS溶液中，再繼續攪拌120 min(700 r·min-1)，冷卻至室溫，4℃冰箱靜置保存。

2.2體外釋放動力學動態透析法考察CMLP-CS和CM的體外釋藥特點。將同濃度的CMLP-CS和CM各1 mL分別投進預先處理好的透析袋，將透析袋分別投入兩種釋放介質(pH 1.2 HCl； pH 6.8 PBS)中，平行操作3份，于水浴恒溫震蕩(37℃，100 r·min-1)，分別于不同時間點取出1 mL釋放介質，同時補充等溫等體積的釋放介質[10]。測定取出的釋放介質中CM的紫外吸光度，計算CM濃度，繪制釋放曲線，并采用相似因子法對釋放曲線進行評價。

2.3大鼠體內藥代動力學

2.3.1給藥方案與樣品采集 將♂ SD大鼠禁食12 h，自由飲水，隨機分為2組，分別灌胃給予CMLP-CS、CM(給藥劑量均為45.0 mg·kg-1)，給藥后于不同時間點大鼠眼眶取血500 μL，6 000 r·min-1離心10 min(離心管已經過肝素預處理)，取上層血漿于-20℃冰箱保存。

2.3.2血漿樣品處理方法 取200 μL待測血漿樣品，加入80 μL尼群地平內標工作液(5 mg·L-1)，乙酸乙酯萃取2次，每次加入500 μL乙酸乙酯，渦旋震蕩5 min后，12 000 r·min-1離心10 min，合并有機相后用氮氣揮干，加入100 μL流動相復溶，吸取20 μL復溶液進樣[12]。

2.3.3樣品測定方法的建立 色譜柱為伊利特C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5.0 μm)；流動相為乙腈 ∶5%冰乙酸溶液=55 ∶45(V/V)；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為430 nm；柱溫為30℃。稱取CM 10 mg，乙醇溶解并定容至50 mL，得200 mg·L-1CM儲備液。取空白血漿200 μL，用CM儲備液配制濃度分別為15、25、50、75、100、200、400 μg·L-1的CM系列血漿溶液，各取20 μL進樣記錄峰面積[12]。以CM和內標的峰面積之比為縱坐標Ss/Si，以CM濃度為橫坐標c，做線性回歸，并計算其回歸方程。

2.3.4方法學考察 取空白血漿，制備高、中、低(400、200、50 μg·L-1)3個濃度的CM血漿樣品，考察精密度，萃取回收率和方法回收率[12]。

2.3.5數據分析 通過DAS 2.1.1軟件計算和分析數據，對CMLP-CS和CM的AUC(0～72h)及cmax等主要藥動學參數進行方差分析，進行90%可信限考察，Tmax采用非參數統計Wilcoxon檢驗，評價CMLP-CS和游離CM是否具有生物等效性(α=0.05)。

3 結果

3.1體外測定方法經考察，制備的CMLP-CS的平均粒徑約為550 nm，平均Zeta電位為23 mV，包封率約為78%。體外標準曲線方程為Y=0.1468X-0.0094，R=0.9999。CM溶液的濃度在0.5～8 mg·L-1范圍內線性良好。日內精密度RSD分別為2.58%、2.03%、1.93%，日間精密度RSD分別為2.67%、3.44%、2.91%，均符合方法學要求。

3.2體外釋放動力學

3.2.1體外釋放曲線 CMLP-CS和CM在兩種釋放介質中的體外釋放曲線，見Fig 1。CMLP-CS在pH 1.2 HCl和pH 6.8 PBS中，48 h內為快速釋放期，累積釋放率分別為(64.99±0.65)%和(63.34±1.23)%，48 h后緩慢并持續釋放。在148 h時，CMLP-CS在pH 1.2 HCl和pH 6.8 PBS中的累積釋放率分別為(70.48±0.50)%和(72.35±1.04)%，分別是游離CM的1.8倍和2.6倍。結果表明，CMLP-CS明顯提高了體外釋放率，可改善體外釋藥行為。

3.2.2溶出曲線評價 采用相似因子法[14]評價溶出曲線，經計算得到的相似因子見Tab 1。CMLP-CS與CM分別在pH 1.2 HCl或pH 6.8 PBS中的相似因子小于50，提示釋放行為不相似，兩者之間沒有明顯差異。此外，CM在pH 1.2 HCl或pH 6.8 PBS中的相似因子大于50，CMLP-CS在pH 1.2 HCl或pH 6.8 PBS中的相似因子大于50，提示它們在pH 1.2 HCl或pH 6.8 PBS中釋放行為相似，而且兩者之間沒有差異，上述結果與Fig 1描述一致。

Fig 1 Drug release curve of CMLP-CS and CM in pH 6.8 PBS(A) and pH 1.2 HCl(B)

Formulation 1 anddissolution mediaFormulation 2 and dissolution mediaSimilarityfactorCM, pH 1.2 HClCMLP-CS, pH 1.2 HCl35.69CM, pH 6.8 PBSCMLP-CS, pH 6.8 PBS33.23CM, pH 1.2 HClCM, pH 6.8 PBS88.29CMLP-CS, pH 1.2 HClCMLP-CS, pH 6.8 PBS89.87

3.3大鼠體內藥代動力學研究

3.3.1測定方法的建立 對濃度c與S(Ss/Si，待測血漿樣品和內標物的峰面積之比)進行線性回歸，得回歸方程為：S=0.010 5c+0.123 3，r=0.9970，CM在15～400 μg·L-1濃度范圍內線性良好，最低檢測限(S/N=3)為5 μg·L-1。該方法在CM低、中、高3個濃度的日內精密度RSD和日間精密度RSD均小于5%，均符合生物樣品分析要求[12]，其萃取回收率和方法學回收率符合含量測定方法要求。

3.3.2藥動學參數 CMLP-CS和游離CM的平均血藥濃度-時間曲線，見Fig 2。經DAS 2.1.1軟件計算分析，主要藥動學參數見Tab 2。Fig 2顯示，CM和CMLP-CS分別在0.25 h和3 h時達到了最大血藥濃度，可知CMLP-CS的達峰時間Tmax是CM的12倍，CMLP-CS的cmax值也明顯大于CM，說明與CM相比，CMLP-CS具有更長的釋放時間，表現出緩釋作用。CMLP-CS的曲線下面積AUC遠遠大于CM，表明CMLP-CS其在體內的吸收效果明顯優于CM，口服生物利用度更好。由Tab 2計算可知，CMLP-CS的AUC(0～72h)值約為CM的8.9倍，CMLP-CS的相對生物利用度為846.5%，CMLP-CS明顯提高了CM的體內口服生物利用度。CMET的MRT(0～72h)大于CM，其值為CM的3.7倍，說明CMLP-CS能夠克服CM在體內被迅速消除的缺點，延長在體內的作用時間，從而利于提高生物利用度。

Fig 2 Mean concentration-time curves of CMLP-CS andfree CM with oral administration (n=6)

Main parameterCMLP-CSCMAUC(0～72 h)/μg·L-1·h-1606.20±93.5867.76±22.12MRT(0～72 h)/h8.23±04.622.24±0.28Cmax/μg·L-1108.71±4.4670.27±11.67Tmax/h3.00±0.000.25±0.00VRT(0～72 h)/h298.87±36.105.41±1.87T1/2/h7.44±1.032.55±0.25

3.3.3生物等效性 由Tab 3可知，CMLP-CS與游離CM的AUC(0～72 h)、AUC(0～∞)兩個參數的90%可置信區間均不在生物等效性標準區間范圍內，因此CMLP-CS與游離CM生物等效性不合格。另外，對達峰時間Tmax進行非參數統計Wilcoxon檢驗，結果顯示，CMLP-CS和CM的達峰時間Tmax差異具有顯著性(P<0.05)。按照生物等效性的判定標準，CMLP-CS與CM生物不等效，CMLP-CS的藥效學標準高于CM。

Tab 3 The bioequivalence comparison of CMLP-CS andCM with oral administration, respectively

4 討論

姜黃素是一類溶解性低、滲透性高的藥物，其口服生物利用度低。本文采用經典的薄膜分散法制備CM納米脂質體，可改善藥物的溶解性，并在脂質體的表面包覆有天然多糖殼聚糖，其生物相容性好、黏附性強，能夠打開胃腸道上皮細胞的膜孔，促進大分子穿過上皮組織的轉運，并通過黏附作用延長脂質體在體內的滯留時間，從而提高生物利用度。

本文將CM制備成CMLP-CS后，在相同的釋放介質中，48 h以前CMLP-CS的釋放速率略快于CM，其原因可能是少部分未包封的CM與兩親性的磷脂結合快速釋放，而48 h后，游離的CM的累積釋放率已達到最高，藥物釋放已接近飽和，而CMLP-CS仍然持續釋放藥物至148 h，具有良好的緩釋效果。其原因可能是包載在親水中心的CM不僅需要穿過磷脂雙分子層，還需要穿過脂質體表面的殼聚糖包衣從而進行釋放，雙重“屏障”可能是其緩釋作用的主要原因。

在體內藥代動力學研究中，CMLP-CS和CM的藥時曲線均出現了雙峰。CM的藥時曲線出現雙峰現象可能是由于CM經口服后在體內快速向組織分布，其中一部分在肝脾等器官中蓄積后再次釋放入血。而CMLP-CS的藥時曲線出現雙峰的原因可能如下：(1)未包封的CM快速入血，包封在脂質體內的CM由于需要穿過磷脂和殼聚糖雙重屏障而達到持續釋放入血，從而達到最大血藥濃度；(2)具有生物黏附性的殼聚糖增加藥物與胃腸道接觸的面積與時間，從而延長了藥物的釋放時間。藥時曲線和主要藥代參數均表明，CMLP-CS可明顯提高CM的在體內的口服生物利用度，其表現出的緩效長效作用與體外釋放動力學考察的結果一致。綜上所述，CMLP-CS可增加體外釋藥量，改善體外釋放行為，明顯提高姜黃素的口服生物利用度，具有良好的促進吸收作用，為進一步研究姜黃素口服納米制劑提供了理論基礎。

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