黃芩素對BCRP介導的人乳腺癌MCF-7/MX細胞多藥耐藥的逆轉作用

付乃潔，王 暢，朱迪穎，劉臨紅，張慧豐, 師銳贊，張明升

(山西醫科大學基礎醫學院藥理學教研室，山西 太原 030001)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發病率和病死率均很高，化療在其綜合治療中起著不可取代的作用。但多藥耐藥 (multidrug resistance, MDR)是乳腺癌化療成功的主要障礙之一。研究表明，多種機制參與MDR的產生、發展過程，其中乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein, BCRP)的過度表達是乳腺癌MDR形成的重要機制之一[1]。BCRP被證實為腫瘤干細胞的標記物之一[2]，是耐藥腫瘤復發和轉移的重要原因。因此，克服BCRP介導的MDR是當前乳腺癌治療中的難點和熱點問題。

黃芩素是從中藥黃芩根部分離得到的有效單體。近年來，多項研究證實黃芩素可通過抑制細胞遷移[3]、增強凋亡[4]等產生明顯的抗腫瘤作用。但有關黃芩素與乳腺癌MDR關系的研究較少，尤其對BCRP介導的MDR作用，國內外尚未見文獻報道。因此，本實驗以人乳腺癌敏感株MCF-7和米托蒽醌(mitoxantrone, MX)誘導的、BCRP高表達的乳腺癌耐藥株MCF-7/MX為細胞模型，通過MTT及Western blot等實驗，研究黃芩素對BCRP介導的MDR的逆轉作用及可能機制，為提高乳腺癌的化療效果提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑人乳腺癌敏感細胞株MCF-7及耐藥細胞株MCF-7/MX由美國國家癌癥研究所Cowan 博士饋贈。黃芩素(baicalein, 純度≥98.0%，批號JPJYH-SI)購自東京化成工業株式會社，以少量DMSO溶解，再用生理鹽水配成4 mmol·L-1的母液，臨用時用RMPI 1640培養液稀釋成相應濃度；四甲基偶氮唑鹽(MTT)粉末、鹽酸米托蒽醌注射液(mitoxantrone hydrochloride, MX, 純度≥95.0%) 購自美國Sigma公司；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU, 批號FA160305)注射液購自上海旭東海普藥業有限公司；順鉑(cisplatin, DDP, 批號161004)注射液購自江蘇豪森藥業集團有限公司；RMPI 1640培養基購自美國Hyclone公司；優質胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、BCRP、NF-κB p65多克隆抗體、β-actin單克隆抗體購自上海生工生物工程股份有限公司；p38 MAPK和p-p38 MAPK單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2儀器SMATB全自動酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；ChemiDoc XRS凝膠成像系統、Mini-PROTEAN垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3細胞培養MCF-7及MCF-7/MX細胞均以含10% FBS的RMPI 1640完全培養基，于37℃條件下在5% CO2細胞培養箱中培養。為維持MCF-7/MX的耐藥性，需在上述細胞培養液中加入終濃度為400 μg·L-1的MX，實驗前2周撤去MX。

1.4MTT法確定黃芩素對MCF-7/MX細胞逆轉耐藥的濃度取對數生長期的細胞MCF-7及MCF-7/MX，接種于96孔板(2×103/孔)，培養24 h后，加入不同濃度的黃芩素(終濃度為640、320、160、80、40、20、10、5、2.5 μmol·L-1)，另設陰性對照組(Control)，每組6個復孔。培養68 h后，每孔加入20 μL MTT，繼續培養4 h，吸去孔內液體后，每孔加入200 μL DMSO，振搖10 min后，用酶標儀于波長570 nm測吸光度(OD)值，計算各濃度的抑制率(inhibition rate, IR)和相對存活率，并繪制細胞增殖抑制曲線，選取IR≤ 15%的濃度作為耐藥逆轉濃度。實驗重復3次。IR/%=[(對照組OD值-加藥組OD值)/對照組OD值]× 100%。

1.5MTT法測定黃芩素對MCF-7/MX細胞的逆轉耐藥作用按照上述方法接種細胞MCF-7及MCF-7/MX，培養24 h后，將MCF-7/MX分為對照組和實驗組。對照組和MCF-7組只加入不同濃度的化療藥物，實驗組同時加入黃芩素及不同濃度的化療藥物，其中黃芩素濃度為上述實驗確定的逆轉濃度；化療藥物包括MX、5-FU、DDP 3種，每組6個復孔，實驗重復3次。計算各組細胞對不同化療藥物的IC50值，按照以下公式計算耐藥指數(resistance index, RI)以及黃芩素的逆轉倍數和相對逆轉率：RI=IC50/IC50(MCF-7)；逆轉倍數=IC50A/IC50B；相對逆轉率/%=(IC50A-IC50B)/(IC50A-IC50C)×100%。其中，IC50A和IC50B分別為黃芩素作用前、后MCF-7/MX細胞對不同化療藥物的IC50值，IC50C為MCF-7細胞對不同化療藥物的IC50值。

1.6Westernblot法檢測BCRP、NF-κBp65、p-p38蛋白的表達差異取對數生長期的MCF-7及MCF-7/MX細胞，接種于6孔板(1.0×105/孔)，培養24 h后，加入逆轉濃度的黃芩素，空白組加入等量的生理鹽水，繼續培養72 h后，每孔加入蛋白裂解液，冰浴裂解1 h，離心收集上清至預冷離心管中，采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品加入SDS-PAGE凝膠中電泳1.5 ～ 2 h，用半干法將凝膠上的蛋白轉印至硝酸纖維素膜上。將膜在5%脫脂奶粉室溫封閉2 ～ 3 h，以一定稀釋度的一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入辣根酶標記山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)，置搖床室溫孵育1 h。避光加入ECL發光液，用凝膠成像系統曝光成像。以β-actin或p38為內參，將條帶標準化，分析蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1MCF-7/MX細胞的MDR表型Fig 1的MTT結果表明，與MCF-7敏感株相比，MCF-7/MX對MX、5-FU、DDP的耐藥倍數分別為：70.45、6.68、21.47。Fig 3的Western blot結果表明，相對于敏感株MCF-7細胞，MCF-7/MX細胞的BCRP高表達(P<0.01)。這些結果證實BCRP是介導MCF-7/MX細胞MDR的重要機制。經黃芩素作用72 h后，MCF-7和MCF-7/MX細胞的IC50分別為28.59 μmol·L-1和27.42 μmol·L-1，差異無顯著性(P>0.05)，證實黃芩素對敏感株MCF-7和耐藥株MCF-7/MX均有殺傷作用，提示黃芩素對MCF-7/MX細胞可能有逆轉耐藥作用。

Fig 1 Resistance of MCF-7 and MCF-7/MX cells

**P<0.01vsMCF-7 cells. IC50values represent the mean of three independent experiments.

Tab 1 Reversal effect of baicalein on drug resistance of MCF-7/MX cells n=3)

Fig 2 Effects of baicalein on proliferative inhibition (A) andrelative viability (B) in MCF-7/MX cells n=3)

**P<0.01vscontrol

2.2黃芩素逆轉耐藥濃度的確定黃芩素(2.5 ～ 640 μmol·L-1)濃度依賴性地抑制MCF-7/MX細胞的增殖。2.5、5 μmol·L-1的黃芩素對MCF/MX細胞的IR分別為(7.06±1.23)%和(13.44±1.88)%，均小于15%，被選擇為逆轉耐藥濃度做后續實驗(Fig 2)。

2.3黃芩素對MCF-7/MX細胞的逆轉耐藥作用2.5、5 μmol·L-1黃芩素與MX、DDP、5-FU聯合使用，可增強MCF-7/MX細胞對這些化療藥物的敏感性(Tab 1)。2.5、5 μmol·L-1的黃芩素對上述3種化療藥物的逆轉倍數分別為(3.57、15.44)、(1.54、2.62)、(1.39、1.93)，相對逆轉倍數分別為(73.00%、94.87%)、(41.70%、72.71%)、(29.40%、50.63%)。

2.4黃芩素對乳腺癌細胞中BCRP表達的影響如Fig 3所示，2.5、5 μmol·L-1的黃芩素作用于MCF-7/MX細胞72 h后，明顯抑制其BCRP的蛋白表達，差異有統計學意義(P<0.01)，且5 μmol·L-1黃芩素組BCRP降低較2.5 μmol·L-1組更明顯(P<0.05)。

2.5黃芩素對乳腺癌細胞中p-p38、NF-κBp65表達的影響如Fig 4所示，相對于MCF-7細胞，MCF-7/MX細胞 p38磷酸化增強，NF-κB p65蛋白表達水平增高。2.5、5 μmol·L-1的黃芩素可減弱MCF-7/MX細胞 p38磷酸化，減少NF-κB p65蛋白表達，差異有統計學意義(P<0.01)，且5 μmol·L-1黃芩素組較2.5 μmol·L-1組作用更明顯(P<0.05)。

3 討論

藥物外排系統的改變是腫瘤耐藥機制中最常見的一種，其中ABC轉運蛋白表達增強會使藥物濃度低于作用濃度，引起腫瘤耐藥[5]。BCRP是ABC轉運蛋白G亞家族成員，在藥物的吸收、分布、消除及獲得性耐藥方面發揮著重要作用[6]。BCRP可特異性地泵出多種化療藥物，如米托蒽醌、拓撲替康、7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN-38)等，降低其化療效果。腫瘤干細胞對多種化療藥物高度耐藥，是癌癥復發和轉移的重要因素[7]。BCRP在腫瘤干細胞中高表達，嚴重阻礙化療成功[8]。因此，BCRP已成為治療多藥耐藥腫瘤以及根除腫瘤干細胞的重要靶點。

Fig 3 Effect of baicalein on expression ofBCRP by Western blot n=3)

1: MCF-7 group; 2: MCF-7/MX group; 3: MCF-7/MX+baicalein (2.5 μmol·L-1) group; 4: MCF-7/MX+baicalein (5 μmol·L-1) group.**P<0.01vsMCF-7 group;##P<0.01vsMCF-7/MX group;△P<0.05vsMCF-7/MX plus 2.5 μmol·L-1baicalein-treated group.

作為中藥黃芩的有效成分之一，黃芩素已被證實可通過降低p-gp藥物外排功能、增加細胞內藥物濃度，逆轉卵巢癌細胞的耐藥[9]；通過抑制糖酵解和PTEN/Akt/HIF-1α信號通路，逆轉胃癌的耐藥[10]；還可通過增強縫隙連接，增強順鉑細胞毒性，提高化療效果[11]。本研究結果證明，黃芩素(2.5、5 μmol·L-1)可增強MCF-7/MX細胞對MX、DDP、5-FU的敏感性，下調BCRP表達，逆轉BCRP介導的乳腺癌細胞MDR。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)是一組重要的絲/蘇氨酸蛋白激酶，可以調節多種細胞活動，包括細胞增殖、分化、凋亡或存活、炎癥、先天免疫等[12]。研究表明，BCRP的蛋白表達上調與p38 MAPK信號通路的激活有密切關系[13]。本實驗也證實，與MCF-7細胞相比，MCF-7/MX細胞的p38磷酸化增強。黃芩素(2.5、5 μmol·L-1)可抑制MCF-7/MX細胞p38的磷酸化。因此，黃芩素下調BCRP表達，可能與其抑制p38 MAPK信號通路有關。

NF-κB在介導腫瘤放、化療耐受的分子機制中處于核心位置。多種信號分子和信號通路，如GSK-3β、p38、PI3K等可影響NF-κB轉錄活性或其上游信號轉導通路，參與調節免疫、生長、炎癥、腫瘤及凋亡等過程[14]。有文獻表明，在BCRP高表達的耐藥細胞中，NF-κB信號通路被明顯激活，抑制NF-κB信號通路可以逆轉腫瘤細胞的MDR[15]。本實驗結果也證實，與MCF-7細胞相比，MCF-7/MX細胞的NF-κB p65蛋白表達升高，黃芩素能降低NF-κB p65的蛋白表達。因此，黃芩素下調BCRP表達，可能與其抑制NF-κB信號通路也有關。

Fig 4 Expressions of p-p38 (A) and NF-κB p65 (B) in different groups by Western blot n=3)

1: MCF-7 group; 2: MCF-7/MX group; 3: MCF-7/MX+baicalein (2.5 μmol·L-1) group; 4: MCF-7/MX+baicalein (5 μmol·L-1) group.**P<0.01vsMCF-7 group;##P<0.01vsMCF-7/MX group;△P<0.05vsMCF-7/MX plus 2.5 μmol·L-1baicalein-treated group.

綜上所述，黃芩素可通過抑制p38 MAPK通路和NF-κB信號通路，下調BCRP蛋白表達，有效逆轉人乳腺癌耐藥株MCF-7/MX細胞的MDR，但其具體作用靶點尚不清楚，還需進一步研究。黃芩素是一種極具開發價值的耐藥逆轉制劑，本研究為黃芩素在逆轉MDR的臨床應用提供了理論支撐，為耐藥乳腺癌的成功治療提供了實驗依據。

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