芪智消渴顆粒對(duì)MPTP誘導(dǎo)斑馬魚(yú)神經(jīng)損傷的保護(hù)作用

王榮春，程麗芳，韓利文，何秋霞，陳錫強(qiáng)，侯海榮，張新軍，李 瑩，劉可春

[1. 齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物檢測(cè)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2. 山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014]

神經(jīng)系統(tǒng)疾病如癲癇、帕金森綜合癥、阿爾茨海默病等疾病都存在神經(jīng)細(xì)胞損傷的共同病理特癥[1]；糖尿病、心血管等多種疾病也伴有神經(jīng)損傷的存在[2]。神經(jīng)損傷包括神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)元周?chē)?xì)胞或組織發(fā)生病變等引起的神經(jīng)元功能異常或缺失。目前認(rèn)為神經(jīng)細(xì)胞損傷的發(fā)生涉及多種生理生化機(jī)制，包括一氧化氮(nitric oxide，NO)蓄積、炎性損傷、氧化損傷、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、自噬等[3-4]。這些過(guò)程往往相互影響，互相促進(jìn)，從而造成神經(jīng)細(xì)胞損傷及凋亡，最終引起各種病理癥狀。神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)藥物的研發(fā)是我國(guó)急需重點(diǎn)突破的領(lǐng)域。采用新型藥物篩選模型，快速發(fā)現(xiàn)藥物對(duì)神經(jīng)功能的保護(hù)作用，將為新藥研發(fā)提供先期實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

已有許多文獻(xiàn)報(bào)道，中藥及有效成分在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防治中體現(xiàn)了巨大的優(yōu)勢(shì)。研究表明，中藥來(lái)源的蘇木素、姜黃素等中藥成分有抗神經(jīng)炎癥的作用，在神經(jīng)保護(hù)方面具有重要作用[5-6]。中藥是多成分體系，通過(guò)多個(gè)環(huán)節(jié)阻止或者延緩神經(jīng)損傷作用，從而保護(hù)神經(jīng)組織免遭更嚴(yán)重的破壞，進(jìn)而提高腦神經(jīng)損傷患者的生活質(zhì)量，并達(dá)到治療疾病的目的。芪智消渴顆粒(Qi Zhi Xiaoke granules，QZXK)處方源于國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)馮建華教授臨床驗(yàn)方，由黃芪、何首烏、益智仁、淫羊藿、雄蠶蛾、熟地、丹參、遠(yuǎn)志、黃連等9味中藥組成，臨床用于中醫(yī)辨證屬脾腎虧損、精血虧虛、瘀血阻絡(luò)、腦髓失養(yǎng)者，可有效治療和改善多種疾病，具有良好的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)功能促進(jìn)作用，在糖尿病患者中有廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)采用斑馬魚(yú)作為神經(jīng)損傷保護(hù)的快速篩選模型，快速檢測(cè)QZXK在神經(jīng)損傷中的保護(hù)作用，并用PC12細(xì)胞系進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，以期為QZXK深入研究與應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 野生型斑馬魚(yú)AB系山東省科學(xué)院斑馬魚(yú)藥物篩選中心提供。成年斑馬魚(yú)在斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)中飼養(yǎng)。水溫控制在(27～28.5) ℃，光照自動(dòng)控制(光照時(shí)間8 ∶00～21 ∶00)，每天喂食2次。

1.1.2細(xì)胞 神經(jīng)細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞(大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤克隆株)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。PC12細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10%馬血清、5%胎牛血清、1×青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日更換培養(yǎng)液。

1.1.3藥物與試劑 QZXK由山東省中醫(yī)藥研究院課題組提供。氨苯甲異喹(nomifensine，Nom)、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)購(gòu)自Sigma公司；MTT細(xì)胞增殖試劑盒、線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、馬血清(horse serum，HS)、RPMI 1640培養(yǎng)基(pH 7.4，高糖)購(gòu)自Gibco公司。

1.1.4儀器 斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛(ài)生公司)；Zebrabox斑馬魚(yú)行為分析儀(Viewpoint公司)；COIC體視顯微鏡ZSA302(重慶光學(xué)儀器廠)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek產(chǎn)品)；無(wú)菌操作臺(tái)SWCJ2購(gòu)自蘇州Airtech公司；5840R離心機(jī)購(gòu)自Eppendof公司。

1.2方法

1.2.1胚胎準(zhǔn)備 斑馬魚(yú)的養(yǎng)殖參照Westerfield等[7]的方法。產(chǎn)卵前1 d傍晚選擇♀♂成對(duì)的斑馬魚(yú)成魚(yú)放入產(chǎn)卵缸中，d 2產(chǎn)卵后收集受精卵，純凈水沖洗3次，放入28℃光照培養(yǎng)箱備用。

1.2.2耐受性考察 將受精后4 h的斑馬魚(yú)胚胎放在培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下挑選發(fā)育正常胚胎于6孔板中，每孔30個(gè)。QZXK劑量組別為5、10、25、50 mg·L-1(養(yǎng)殖水配制)和空白對(duì)照組(養(yǎng)殖水)，每孔給予不同劑量QZXK溶液5 mL，每個(gè)劑量組分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，給藥后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)控光培養(yǎng)。每24 h更換藥液，連續(xù)處理3 d。觀察斑馬魚(yú)幼魚(yú)發(fā)育，并記錄給藥后72 h斑馬魚(yú)孵化情況，計(jì)算其孵化率。

1.2.3行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 將受精后72 h斑馬魚(yú)放在培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下挑選發(fā)育正常幼魚(yú)于6孔板中，每孔10尾幼魚(yú)。實(shí)驗(yàn)分為QZXK組5、10、25、50 mg·L-1、空白對(duì)照組(養(yǎng)殖水)和Nom陽(yáng)性對(duì)照組10.63 mg·L-1，每孔均為5 mL，每個(gè)劑量組別設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)控光培養(yǎng)。給藥后2 h后加入MPTP，終濃度為200 μmol·L-1，每24 h更換藥液，連續(xù)處理3 d后，將不同組幼魚(yú)分別放在48孔板中，放入斑馬魚(yú)行為學(xué)分析系統(tǒng)的暗箱中，使用Zeblab軟件分別采集10 min內(nèi)各組幼魚(yú)的運(yùn)動(dòng)軌跡，利用軟件導(dǎo)出游行距離和次數(shù)，計(jì)算每組魚(yú)游行總距離。

1.2.4MTT實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，用含100 mg·L-1胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度5×107·L-1，每孔100 μL接種于96孔板，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸盡培養(yǎng)基，每孔依次加入100 μL對(duì)照培養(yǎng)基，并用2 mmol·L-1的MPTP處理2 h后，加入QZXK進(jìn)行處理(終濃度分別為5、10、25 mg·L-1)，每個(gè)劑量設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，加入MTT溶液(5 mg·L-1)20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加入100 μL DMSO，搖床振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在570 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度( A570 nm) 值。細(xì)胞存活率/%=測(cè)定組A570 nm/正常組A570 nm×100%。

1.2.5線(xiàn)粒體膜電位的檢測(cè) PC12細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，先用2 mmol·L-1MPTP處理2 h。然后加入QZXK(5、10、25 mg·L-1)，作用48 h后，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌培養(yǎng)板1次，然后各孔加入JC-1工作液(終濃度為10 mg·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)15 min，PBS洗滌后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)，并用熒光顯微鏡拍照。紅色熒光：560 nm激發(fā)波長(zhǎng)/595 nm發(fā)射波長(zhǎng)；綠色熒光：485 nm激發(fā)波長(zhǎng)/535 nm發(fā)射波長(zhǎng)，以紅色/綠色比值進(jìn)行比較，并根據(jù)對(duì)照組進(jìn)行歸一化[8]。

1.2.6Caspase-3蛋白活性的檢測(cè) PC12細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于12孔板中，培養(yǎng)24 h后加藥處理，先用2 mmol·L-1的MPTP處理2 h，QZXK(5、10、25 mg·L-1)作用48 h后，收集細(xì)胞，加入PBS洗滌細(xì)胞2次，然后轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管內(nèi)，離心并吸除上清。加入細(xì)胞裂解液反應(yīng)5 min，12 000 r·min-1離心5 min。將15 μL裂解液與50 μL反應(yīng)液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，室溫反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)490 nm激發(fā)波長(zhǎng)/520 nm發(fā)射波長(zhǎng)，并統(tǒng)計(jì)活性比值。

2 結(jié)果

2.1QZXK對(duì)斑馬魚(yú)胚胎孵化發(fā)育的影響在本實(shí)驗(yàn)劑量范圍，對(duì)照組斑馬魚(yú)生長(zhǎng)良好，無(wú)病理改變及畸形，軀體及眼睛均覆蓋熒光斑點(diǎn)，均勻分布，邊界清晰，無(wú)缺失；72 hpf所有QZXK組斑馬魚(yú)都孵化良好，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Tab 1)。

2.2QZXK對(duì)MPTP誘導(dǎo)斑馬魚(yú)神經(jīng)損傷作用以72 hpf的斑馬魚(yú)幼魚(yú)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用濃度200 μmol·L-1的MPTP進(jìn)行神經(jīng)損傷造模處理，可以造成斑馬魚(yú)幼魚(yú)活動(dòng)減少，行為受到抑制，用陽(yáng)性藥Nom和不同劑量的QZXK(0、5、10、25、50 mg·L-1)溶液進(jìn)行處理，結(jié)果表明，處理72 h后，陽(yáng)性藥Nom可以明顯延長(zhǎng)斑馬魚(yú)自發(fā)運(yùn)動(dòng)距離，25、50 mg·L-1的QZXK溶液組的斑馬魚(yú)自發(fā)運(yùn)動(dòng)距離明顯比模型組延長(zhǎng)(Fig 1、Tab 2)。

Fig 1 Effect of QZXK on behavior trajectory of zebrafish

GroupConcentration/mg·L-1Hatching rate at 72 hpf/%Control-100.00±0.00QZXK596.00±5.7110100.00±0.002598.00±2.805096.67±5.70

Tab 2 The swimming distance of zebrafish treated with QZXK and/or

##P<0.01vscontrol;*P<0.05，**P<0.01vsmodel

2.3QZXK對(duì)MPTP誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的作用如Fig 2所示，與正常對(duì)照組相比，MPTP可以造成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡，降低細(xì)胞活力；與模型組相比，隨著QZXK劑量的增高(5、25 mg·L-1)可以提高M(jìn)PTP處理組的細(xì)胞活力，說(shuō)明QZXK對(duì)PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用。

2.4QZXK對(duì)PC細(xì)胞膜電位和caspase-3的影響正常細(xì)胞的線(xiàn)粒體膜電位可以引起JC-1聚合，呈現(xiàn)紅光；當(dāng)線(xiàn)粒體受損后，膜電位下降，JC-1聚集能力減弱，出現(xiàn)單體形式，呈現(xiàn)綠光，以紅色/綠色熒光比率顯示細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的損害情況。如Fig 3、4所示，與對(duì)照組相比，25 mg·L-1的QZXK引起紅色/綠色熒光比率的降低，差異有顯著性(P<0.05)。caspase-3活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組比正常對(duì)照組caspase-3活性明顯提高；而QZXK處理組與模型組相比，5、25 mg·L-1的QZXK可以抑制caspase-3活性(Fig 5)，說(shuō)明QZXK可以抑制MPTP引起的細(xì)胞凋亡。

Fig 2 The cell viability of PC12 treated

##P<0.01vscontrol;*P<0.05，**P<0.01vsmodel

Fig 3 Effect of QZXK on mitochondrial membrane potential of PC12 cells

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsmodel

Fig 4 QZXK attenuated MPTP-induced mitochondrial membrane potential loss(scale bar=200 μm)

A1-A2：Control; B1-B2：PC12 cells treated with 2 mmol·L-1MPTP; C1-C2：PC12 cells treated with 2 mmol·L-1MPTP and 2 mg·L-1QZXK; D1-D2：PC12 cells treated with 2 mmol·L-1MPTP and 5mg·L-1QZXK; E1-E2：PC12 cells treated with 2 mmol·L-1MPTP and 25 mg·L-1QZXK; F1-F2：PC12 cells treated with 25 mg·L-1QZXK.

Fig 5 Effect of QZXK on caspase-3 activity

##P<0.01vscontrol;*P<0.05，**P<0.01vsmodel

3 討論

斑馬魚(yú)的神經(jīng)系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物類(lèi)似，具有單胺類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)，其體內(nèi)具有5-羥色胺、去甲腎上腺素等遞質(zhì)系統(tǒng)，也具有多巴胺神經(jīng)元。斑馬魚(yú)與人類(lèi)都以皮質(zhì)醇作為應(yīng)激反應(yīng)激素[9-10]。同時(shí)，斑馬魚(yú)飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)、發(fā)育快速、產(chǎn)卵量大、胚胎透明、易于觀察，鑒于斑馬魚(yú)這些生理特點(diǎn)，使其成為具有重要的模式生物。目前，斑馬魚(yú)已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)損傷和行為學(xué)等神經(jīng)科學(xué)研究，斑馬魚(yú)在藥物的篩選和功效評(píng)價(jià)的研究過(guò)程中受到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。MPTP是一種具有強(qiáng)親和毒素的非單純哌啶類(lèi)鎮(zhèn)定劑藥物，高度脂溶，容易通過(guò)血腦屏障。MPTP進(jìn)入腦內(nèi)，被膠質(zhì)細(xì)胞和5-羥色胺能神經(jīng)元攝取，在細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體單胺氧化酶B(monoamine oxidase B，MAO-B)作用下，轉(zhuǎn)化為具有毒性的1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)，然后釋放到細(xì)胞外，造成神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和損壞，從而模擬神經(jīng)損傷，為神經(jīng)損傷保護(hù)相關(guān)藥物的篩選和評(píng)價(jià)提供了一個(gè)快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚11-12]。本實(shí)驗(yàn)用MPTP建立斑馬魚(yú)神經(jīng)損傷模型，發(fā)現(xiàn)MPTP對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)神經(jīng)造成損傷，從而影響斑馬魚(yú)的行為學(xué)變化，對(duì)斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)軌跡產(chǎn)生影響，并降低斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)距離。我們通過(guò)給予不同劑量的QZXK，發(fā)現(xiàn)隨著劑量的提高，QZXK對(duì)MPTP造成的神經(jīng)損傷具有一定的保護(hù)作用，可以提高斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)距離，逆轉(zhuǎn)斑馬魚(yú)的行為異常。斑馬魚(yú)神經(jīng)損傷模型非常適合藥物初期的篩選和評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，為其它中藥或中藥成分的篩選和評(píng)價(jià)提供了一個(gè)快速、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型線(xiàn)粒體損傷廣泛存在于神經(jīng)細(xì)胞損傷過(guò)程中，線(xiàn)粒體膜上存在滲透性轉(zhuǎn)化孔，各種有害刺激如缺氧、NO聚集、細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加等，都可造成轉(zhuǎn)化孔開(kāi)放，從而引起膜電位下降甚至消失，呼吸鏈和氧化磷酸化受到破壞，ATP合成量減少；而生成的氧自由基進(jìn)一步損傷細(xì)胞膜形成脂質(zhì)過(guò)氧化，胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性和DNA交聯(lián)，最終造成細(xì)胞凋亡[13-14]，對(duì)線(xiàn)粒體膜電位的保護(hù)作用可以引起神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，QZXK可以抑制MPTP對(duì)線(xiàn)粒體膜的損傷，并抑制凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的活性。QZXK對(duì)線(xiàn)粒體具有一定的保護(hù)作用，也為QZXK拮抗MPTP對(duì)斑馬魚(yú)神經(jīng)損傷提供了分子研究基礎(chǔ)。綜上，本研究通過(guò)藥物MPTP建立斑馬魚(yú)和PC12細(xì)胞神經(jīng)損傷模型，并利用該模型證明了QZXK在MPTP造成的神經(jīng)損傷過(guò)程中具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞活力有關(guān)，為QZXK改善認(rèn)知功能提供了一定的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為中藥的篩選和評(píng)價(jià)提供了一個(gè)快速、準(zhǔn)確的試驗(yàn)方法。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)于山東省科學(xué)院生物研究所藥物篩選研究室完成，在此表示衷心感謝！)

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