Arrb2基因敲除小鼠的繁育及基因型鑒定

孫嫵弋，孫家昌，厲歆然，彭文婷，魏 偉

(安徽醫科大學臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，抗炎免疫藥物安徽省協同創新中心，安徽 合肥 230032)

β-arrestin2屬于Arrestin家族的一種調控蛋白，其基因編碼為Arrb2，是在提純β腎上腺素受體激酶的過程中被發現的。它不僅可以調節G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors, GPCRs)的脫敏和內化[1]，還可以對酪氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor，TKR)、絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等介導的信號轉導產生一定影響，在細胞的增殖、凋亡及炎癥反應中都起著至關重要的作用[2]。β-arrestin2廣泛分布于各個組織器官，在惡性腫瘤、纖維化等多種疾病中，發揮重要的調控作用，使其成為研究熱點[3]。Arrb2基因敲除模型可以利用敲除編碼β-arrestin2的基因，從整體水平研究β-arrestin2蛋白的功能。本文針對Arrb2基因敲除小鼠的繁育和基因型鑒定，對其方法學進行探討和優化，旨在為相關機制的研究建立更好的Arrb2敲除動物模型。

1 材料

1.1實驗動物Arrb2基因敲除型(KO)純合子(-/-)小鼠，♂，購自美國Jackson 實驗室，為C57BL/6J遺傳背景。野生型(wide type，WT) C57BL/6J小鼠購自中國科學技術大學生命科學學院實驗動物中心。實驗動物均在無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級條件動物房飼養及繁育。所有實驗動物的操作及飼養均符合國標及安徽省實驗動物管理飼養條例。

1.2試劑Genotyping Mix(美國Kapa Biosystems公司)；瓊脂糖凝膠(美國Genetech公司)；Proteinase K(美國Sigma Aldrich公司)；異丙醇(上海試劑一廠)；RIPA蛋白裂解液、苯甲基磺酰氯(phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF)、5×電泳加樣緩沖液(碧云天生物技術公司)；抗β-actin抗體、抗β-arrestin2抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物公司)；ECL化學發光試劑盒(美國Pierce Biology公司)。

1.3儀器通用型電泳儀JY200C(北京君意儀器廠)，熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，Tanon-1600全自動數碼凝膠圖像分析系統(上海天能公司)，LAS4000Mini型化學發光成像分析儀(美國GE公司)。

2 方法

2.1Arrb2基因敲除小鼠的飼養繁殖Arrb2基因敲除小鼠于中國科學技術大學生命科學學院實驗動物中心SPF級動物房內飼養和繁殖。飼養溫度18～22℃，相對濕度40%～70%，明暗循環12 h/d，自由飲食和飲水。小鼠籠盒、墊料、飼料、飲用水均經過高溫高壓消毒滅菌處理。同時，小鼠定期給予滅菌葵花籽以補充營養。飼養過程中，每天進入SPF動物房觀察和記錄小鼠的生長情況。每周更換2次小鼠墊料，每天補充飼料和飲用水。繁殖初期，純合♂鼠與野生型♀鼠1 ∶2進行合籠，小鼠的性成熟期為8周左右，母鼠妊娠期為21 d左右。繁殖出F1代雜合子鼠后，1 ∶2進行合籠，以便得到更多F2代小鼠進行檢測。

2.2小鼠尾部組織基因組DNA的提取待子鼠2周齡時，將小鼠尾部組織剪取長約0.5 cm的小段于1.5 mL EP 管中，加入490 μL的鼠尾裂解緩沖液和10 μL Proteinase K，槍頭抽吸混勻，60℃水浴過夜。隔天置于沸水中煮10 min，終止裂解。置于4℃冰箱中，待管中析出大量白色絮狀蛋白后，10 000×g離心10 min，吸取上清至另一新的1.5 mL EP管中，加入同等體積預冷的異丙醇，混勻，室溫靜置10 min，10 000×g離心10 min。棄上清，加入1 mL預冷的70%乙醇10 000×g離心10 min，棄上清。室溫下靜置30 min使乙醇揮發，再加入30 μL去核酸水溶解，置4℃冰箱備用。

2.3PCR擴增反應及瓊脂糖凝膠電泳進行基因型鑒定

2.3.1引物設計 引物序列由上海Invitrogen公司合成，Wild type: 5′-GCCTGAGTGTTCCCTGAAGA-3′，Common: 5′-C TGAAAGGTGGGTGTCCTGT-3′，Mutant: 5′-AAAAGCGCCTCC CCTACG-3′。目的基因片斷長度分別為186 bp 和224 bp。

2.3.2PCR體系 去核酸水7.75 μL，Genotyping Mix 12.5 μL，3種引物各加入1.25 μL，目的基因樣本加入1 μL。采用PCR儀進行擴增，反應條件為：預變性95℃ 3 min，變性95℃ 15 s，退火60℃ 15 s，延伸72℃ 15 s，循環40次，72℃ 1 min 終止反應。

2.3.32%瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖0.6 g，1×TAE buffer 30 mL，溴化乙啶(EB) 1 μL；上樣DNA 10 μL，電泳電壓110 V，時間為50 min。于化學發光凝膠成像系統中拍照觀察。

2.3.4基因型結果判定 Common和mutant引物擴增產物長度為186 bp 左右條帶，為KO小鼠；Wild type和common引物擴增產物長度為224 bp左右條帶，為WT小鼠；兩條電泳條帶均存在的為雜合小鼠。

2.4Westernblot檢測β-arrestin2蛋白的表達提取F2代小鼠肝組織和腎組織總蛋白，進行標準蛋白定量。上樣后采用10% SDS-PAGE電泳，后轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入β-arrestin2一抗(1 ∶1 000)，4℃孵育過夜，次日用TPBS洗3次，每次10 min，加入對應山羊抗小鼠IgG(1 ∶6萬)，室溫孵育2 h，TPBS洗3次，每次 10 min。PBS洗10 min，化學發光成像分析儀掃膜并采集圖像，定影。Image J 軟件分析目的條帶灰度值。

3 結果

3.1小鼠的繁殖情況F1代母鼠成功繁殖出子代幼鼠(F2)。將獲得的F2代純合子小鼠與異性雜合子交配，成功繁殖出更多的基因敲除純合子小鼠(F3)。每只母鼠妊娠期為19～21 d，每胎產3～8只幼鼠，成活率>90%。純合Arrb2基因敲除小鼠體型相比雜合子小鼠較小(Fig 1)，且幼崽相對不易存活。

3.2小鼠基因型鑒定結果F2代部分小鼠基因型鑒定結果見Fig 2A，其中1、2、3、4、6號出現1條224 bp的條帶，為野生型小鼠；5、7、9號分別出現186 bp 和224 bp兩條條帶，為雜合子小鼠；8號出現1條186 bp的條帶為純合子小鼠。把F2代純合子小鼠和異性雜合子小鼠挑出進行合籠，產生F3代小鼠進行基因型檢測，結果見Fig 2B，其中1、2、5、7、8、9號出現186 bp 和224 bp 的兩條條帶，為雜合子小鼠；3、4、6只出現1條186 bp 左右條帶，為純合子小鼠。分別挑選♀、♂純合子基因型小鼠進行擴繁，得到的F4代及以后只出現1條186 bp 左右條帶(Fig 2C)，全部為純合基因敲除小鼠。

3.3基因敲除小鼠β-arrestin2蛋白表達情況為了進一步確認PCR結果的可靠性，我們選取經PCR鑒定獲得的野生型、純合子、雜合子小鼠，應用 Western blot方法檢測β-arrestin2蛋白在肝臟和腎臟組織中的表達。結果如Fig 3、4所示，野生型和雜合型小鼠臟器中可見β-arrestin2蛋白的表達，純合子小鼠臟器幾乎不表達β-arrestin2蛋白，結果與PCR方法鑒定所得的結果一致。說明應用PCR方法鑒定小鼠基因型結果快捷、可靠。

Fig 1 Appearance of F3 generation mice at difference age

Fig 2 Results of genotype identification of mice by PCR

A: Genotype identification of F2 generation mice; B: Genotype identification of F3 generation mice; C: Genotype identification of F4 generation mice. M: Marker; 1-9: Mice of F2, F3 or F4 generation.

Fig 3 Expression of β-arrestin2 in liver of different genotypes

**P<0.01vsArrb2+/+group

4 討論

Arrestin基因家族是一類信號調控蛋白，分子質量為48～55 ku，由4個成員構成。arrestin1主要分布在視網膜視桿和視錐細胞，被稱做視覺arrestin；arrestin4僅分布在視網膜視錐細胞中，又稱錐體arrestin；β-arrestin1(arrestin2)和β-arrestin2 (arrestin3)廣泛分布在體內各個組織中[4]。β-arrestin1和β-arrestin2在結構上有78%的氨基酸是相同的，在功能上也有所重疊[5]。在基因敲除的過程中發現，單獨敲除β-arrestin1或β-arrestin2的小鼠可以存活，同時敲除則致死，說明β-arrestin1和β-arrestin2在生理功能上有所重疊，且至關重要[6]。大量研究表明，β-arrestin2與多種疾病的發生密切相關。β-arrestin2與GPCRs結合后，可以從空間結構上阻止GPCRs與配體的結合，還能通過募集磷酸二酯酶4D和二乙酰激酶等，降解GPCRs信號轉導通路中的第二信使環磷酸腺苷，從而終止GPCRs下游信號的轉導[7]。除此之外，β-arrestin2還可以作為激酶信號通路的支架蛋白，與Src家族酪氨酸激酶、細胞外信號調節激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶3(c-Jun amino-terminal kinase 3，JNK3)等信號分子結合，形成支架蛋白復合物，將胞膜信號傳導到激酶信號通路中[8]。β-arrestin2還可以通過調節免疫細胞，參與免疫反應[9]。

Fig 4 Expression of β-arrestin2 in kidney of different genotypes

**P<0.01vsArrb2+/+group

β-arrestin2在肝臟、腎臟等臟器中有豐富的表達。β-arrestin2可作為糖尿病研究的新靶點，在糖尿病腎病模型中，相比正常組，模型組小鼠腎臟中β-arrestin2的表達出現明顯下降。在Ⅱ型糖尿病小鼠模型中，β-arrestin2敲除小鼠在糖代謝方面存在嚴重的缺陷，β-arrestin2過表達可明顯提高對胰島素的敏感性[10-11]。本課題組前期建立豬血清誘導的肝纖維化模型，研究發現隨著肝纖維化程度加重，肝組織中β-arrestin2的表達逐漸增加。此研究表明β-arrestin2與肝纖維化疾病的發病機制有一定的聯系，提示β-arrestin2可能促進了肝纖維化的發展[12]。在博來霉素誘導的小鼠肺纖維化模型中，β-arrestin1或β-arrestin2的缺失可以減少細胞外基質和膠原的沉積，保護肺功能[13]。此外，自身免疫病、心血管系統疾病、神經系統疾病、腫瘤等疾病的發生、發展，均發現與β-arrestin2有密切聯系[14]。因此，β-arrestin2相關作用機制的研究還需不斷地探索和發展。

基于此我們引進了β-arrestin2基因敲除小鼠，并按照SPF級標準進行飼養繁育。采用較為簡便易行、重復性、適用性較好的瓊脂糖凝膠電泳的方法，進行基因型分型。由于β-arrestin2廣泛參與多種生理過程，該基因的敲除可能會造成生長發育的部分功能減弱或障礙，在飼養過程中我們也發現，Arrb2基因敲除純合子小鼠相對體型較小，所以在飼養和繁殖的過程中要格外注意。本次實驗我們采用雜合子小鼠雜交方式繁育，篩選所需基因型，野生型和純合子小鼠可進行對照造模，進行表型分析；剩余的雜合子小鼠又可進行保種再繁育解決后續問題，該方法恰好能夠同時兼顧兩方面的需求。通過一段時間的飼養我們得到了一批基因敲除小鼠，這為β-arrestin2相關機制的研究提供了較好的模型，對整體實驗具有重要意義。

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