新型非酒精性脂肪肝模型建立及免疫細胞機制探討

陳一平，肖百全，張景鴻，劉位位，肖亞強，李超乾

(1. 廣西醫(yī)科大學附屬民族醫(yī)院/廣西民族醫(yī)院老年病科，廣西 南寧 530001；2. 廣東省生物資源應用研究所藥物非臨床評價研究中心，廣東 廣州 510990；3. 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院急診科，廣西 南寧 530021；4. 廣西急診與醫(yī)學救援人才小高地，廣西 南寧 530021；5. 廣西醫(yī)科大學研究生院，廣西 南寧 530021；6. 廣西衛(wèi)生職業(yè)技術學院醫(yī)學系，廣西 南寧 530023)

隨著肥胖及代謝綜合征的流行，非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)的發(fā)病率及患病率也呈現(xiàn)逐年增長的趨勢[1]。橫斷面研究顯示[2]，全球有西方膳食習慣成人中，20%～30%存在肝臟過量脂肪沉積，2%～5%的NAFLD患者存在明顯肝臟損害，1%～2%的成人存在患非酒精性脂肪肝炎導致肝硬化的風險。NAFLD明確能使部分肝硬化患者肝功能失代償，并最終導致死亡或肝移植。另外，NAFLD也造成了國家巨大的經(jīng)濟負擔，美國在該病每年花費估計1030億美元，而英國、德國、法國和意大利花費350億英鎊[3]。我國有研究通過調(diào)查6 450名職業(yè)人群，發(fā)現(xiàn)NAFLD 的患病率為21.71% ，男性為28.68% ，女性為14.47%[4]，雖然尚無大數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果，但也能充分說明NAFLD在我國的嚴峻形勢。

為了研究NAFLD的發(fā)病機制及治療方法，制備出接近人類疾病過程，且成功率、重復率高的動物模型顯得尤為重要。目前，常用的NAFLD模型建立主要有化學藥物誘導、病毒誘導、高脂飼料誘導或轉(zhuǎn)基因及基因敲除動物等方法[5]。眾所周知，西方飲食習慣是導致人類肝臟過量脂肪沉積的主要原因[2],膳食因素也是導致人類NAFLD的主要病因[6],所以，高脂飲食誘導是最接近人類發(fā)病過程的造模方法。目前，研究對模型動物的選擇、高脂飼料的配比及是否應用輔助藥物干預等各不相同，但由于小鼠自由攝食存在攝入量不可控，影響模型成功率的缺陷，本研究通過基礎飼養(yǎng)聯(lián)合高脂腸內(nèi)營養(yǎng)劑灌胃誘導，建立C57BL/6J小鼠NAFLD模型，為該疾病模型的建立及疾病相關研究提供參考和借鑒。

1 材料

1.1實驗動物SPF級C57BL/6J♂小鼠，3～4周齡，剛斷乳，體質(zhì)量17～21 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2013-0004。模型制作在廣東萊恩醫(yī)藥研究院SPF級動物房觀察室完成，許可證號：SYXK(粵)2015-0146。動物房環(huán)境溫度(20～26) ℃，日溫差不超過4 ℃，相對濕度40%～70%，換氣次數(shù)≥15次/h，12 h照明/12 h黑暗明暗交替，自由攝食攝水。

1.2飼料配方及供能比基礎飼料：采用上海普路騰生物科技有限公司小鼠基礎飼料，供能比：脂肪12.3%、蛋白21.5%、碳水化合物66.2%。參考李曉沖等[7]高脂飼料配方比例，并加以改進,高脂腸內(nèi)營養(yǎng)劑配方：20%蔗糖+20%豬油+2%膽固醇+1%膽酸鹽。供能比：脂肪69.2%、碳水化合物30.8%。

1.3試劑血清總膽固醇(total cholesterol，TC)批號：16803、甘油三酯(triglyceride，TG)批號：161004、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)批號：16703、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)批號：16302、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)批號：161206、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase，AST)批號：160904，以上試劑盒均購自浙江伊利康生物技術有限公司；抗小鼠CD4 Percp-cy5.5(批號：550954)、PE標記大鼠抗小鼠IL4(批號：554435)、PE-Cy7標記 小鼠抗小鼠NK-1.1(批號：552878)、Ms CD3e APC 145-2c11(批號：100326),以上流式熒光抗體均購自美國BD公司；膠原酶IV(批號：V900893),購自美國Sigma公司。

1.4儀器FACSVerse型流式細胞儀(美國BD公司)；EG1150H型石蠟包埋機+EG1150C型冷臺、ST5020型多功能染色機、DM3000生物顯微鏡(ebp100-04-L熒光)型，均購自德國LEICA公司；病理圖像分析系統(tǒng)：DFC450+圖像采集軟件Leica Application Suite V4，德國LEICA公司；7020型全自動生化分析儀(日本日立公司)。

2 方法

2.1動物分組及模型制備檢疫合格的C57BL/6J小鼠經(jīng)3 d適應性喂養(yǎng)后，按體質(zhì)量隨機均衡地分為2組，即對照組和模型組，每組20只。所有小鼠均自由攝食(基礎飼料)及飲水。根據(jù)藥理實驗方法學[8]，并結合本實驗室既往研究經(jīng)驗，模型組每日上、下午給予高脂腸內(nèi)營養(yǎng)劑，按每10 g體質(zhì)量0.3 mL灌胃，對照組給予同樣劑量的純水灌胃。喂養(yǎng)12周及16周分別處死10只小鼠，進行相關指標檢測。

2.2肝指數(shù)測定用丙泊酚麻醉小鼠后，稱其體質(zhì)量，摘眼球放血后，開腹分離肝臟，觀察肝臟大小、顏色、形狀，稱量肝臟重量，并計算肝指數(shù)。肝指數(shù)=肝臟重量(g)/體質(zhì)量(g)。

2.3病理學檢測切取適量肝臟組織制作新鮮冰凍切片，再進行油紅O染色，2名病理醫(yī)師在光學顯微鏡下進行雙盲閱片。按照30%以上肝細胞脂肪變性者視為脂肪肝，75%以上肝細胞脂肪變性者視為重度脂肪肝標準得出結論，如存在爭議，請第3名病理醫(yī)師閱片。

2.4血清學指標檢測所有小鼠均在早上8點采血，腹主動脈采血分離血清，按照試劑盒操作步驟，應用全自動生化分析儀進行ALT、AST、TC、TG、HDL、LDL等生化指標檢測。

2.5流式細胞術檢測肝臟NKT細胞及其活性按照本課題組前期研究實驗方法[9]稍有改動：用3 mL 40% Percoll重懸小鼠肝細胞的細胞懸液，室溫下2 400 r·min-1離心30 min，吸取含紅細胞層，加紅細胞裂解液3 mL，暗處放置4 min，過濾后，1 500 r·min-1離心5 min，1 mL RPMI 1640細胞培養(yǎng)液重懸，制成肝臟單細胞懸液備用。取肝臟單細胞懸液100 μL，依次加入percp5.5-CD4、FITC-CD69、PECY7-NK1.1、APC-CD3各1.5 μL輕柔混合，暗室室溫孵育20 min。PBS液3 mL，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入1%多聚甲醛200 μL，于4℃冰箱內(nèi)固定過夜,24 h內(nèi)上機檢測。CD3+NK1.1+細胞為自然殺傷T細胞(natural killer T cells, NKT cells)，CD3+NK1.1+IL-4+細胞為IL-4+NKT細胞，CD3-NK1.1+細胞為自然殺傷細胞(natural killer cells，NK cells)，CD3+CD4+細胞為輔助性T細胞(helper T cells，Th cells)。

3 結果

3.1實驗動物大體情況各組小鼠造模過程中均未出現(xiàn)死亡，對照組小鼠生長及生活習性正常，模型組小鼠在喂養(yǎng)后期，特別是造模12周以后到16周實驗結束時，出現(xiàn)體型稍大、反應遲鈍、懶動表現(xiàn)。

3.2小鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)變化對照組肝臟呈鮮紅色，邊緣銳利。模型組12周時肝臟呈現(xiàn)色澤變黃、油膩感，16周上述表現(xiàn)加重，并出現(xiàn)肝臟體積增大，邊緣變鈍現(xiàn)象。Tab 1結果顯示，模型組體質(zhì)量較對照組有增加，但差異無顯著性(P>0.05)；肝指數(shù)較對照組明顯增加，以16周時更加明顯(P<0.05)。

3.3血清學指標的變化Tab 2、3結果顯示，與對照組相比，模型組ALT及AST水平在造模12周時差異無顯著性(P>0.05),16周時出現(xiàn)明顯差異(P<0.05)；與本課題組之前研究結果類似[10]，模型組TC水平在12周明顯升高(P<0.05)，16周時差距有所減小，但差異仍有顯著性(P<0.05)；TG水平在12周時降低，但差異無顯著性(P>0.05)，16周時差異進一步縮小；HDL水平在12周及16周時，降低均不明顯(P>0.05)；LDL在12周時明顯升高(P<0.05),16周時差異更加明顯(P<0.01)。

Tab 1 Changes of body weight and liver index n=10)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Tab 2 Changes of liver function and blood lipid level in 12 weeks n=10)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Tab 3 Changes of liver function and blood lipid level in 16 weeks n=10)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Tab 4 Changes of different lymphocytes n=10)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 1 Changes of different lymphocytes

A：Control NK cells and NKT cells; B: Model NK cells and NKT cells; C: Control IL-4+NKT cells; D: Model IL-4+NKT cells; E: Control Th cells; F: Model Th cells.

3.4肝臟不同淋巴細胞變化如Fig 1、Tab 4所示，與對照組相比，模型組NKT細胞比例升高，差異具有顯著性(P<0.05)，IL4+NKT細胞比例明顯升高(P<0.01)，而NK細胞比例有升高趨勢，Th細胞比例有下降趨勢，但差異均無顯著性(P>0.05)。

3.5肝臟病理學檢查結果如Fig 2所示，16周時，對照組也有少量肝細胞脂肪浸潤，模型組脂肪浸潤明顯，脂肪變性的肝細胞明顯超過75%，與造模12周的小鼠肝臟病理相比，肝細胞脂肪變性數(shù)量及程度都更加嚴重。但是,不論是在12周，還是16周,模型組肝臟纖維化表現(xiàn)均不明顯。

4 討論

小鼠NAFLD模型模擬人類因長期高脂高糖膳食，導致過量脂肪在肝臟沉積引起脂肪肝的疾病過程。常見膳食誘導方法是高脂高糖飼料[5]或者蛋氨酸/膽堿缺乏飼料(methionine -choline deficient diet，MCD)[11]喂養(yǎng)小鼠，或聯(lián)合應用丙基硫氧嘧啶抑制膽固醇分解，增加脂質(zhì)在肝臟中沉積，或聯(lián)合應用四氯化碳加重肝臟損害，縮短成模時間等方法[12]。但是單純高脂高糖飼料喂養(yǎng)，溫度、濕度、氣壓、光照條件等的細微變化，以及高脂飼料本身因為質(zhì)地較軟不利小鼠磨牙等原因，都可以造成小鼠攝食量改變，影響最終模型的成功率。而使用特殊制作飼料或者聯(lián)合化學藥物提高模型成功率的方法，與人類NAFLD的發(fā)病過程始終存在較大差異。本研究中，應用高脂高糖腸內(nèi)營養(yǎng)劑灌胃保證小鼠攝食量，同時以基礎飼料自由進食及磨牙棒使用盡可能減少對牙齒的影響。為了避免長期灌胃造成小鼠食道及氣道損傷，本研究實驗操作人員均為廣東萊恩醫(yī)藥研究院長期從事藥物毒理研究的熟練實驗員，實驗過程中，無1只小鼠因灌胃操作出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象。

Fig 2 Photomicrographs of liver in mice(frozen section, red oil O×200)

A: Control 12 weeks; B: Model 12 weeks; C: Control 16 weeks; D: Model 16 weeks.

本研究終點，模型組小鼠并未出現(xiàn)體質(zhì)量明顯增加，原因考慮為在模型建造初期，每10 g體質(zhì)量0.3 mL劑量的高脂腸內(nèi)營養(yǎng)液導致小鼠出現(xiàn)活動明顯減少、精神萎靡、體溫下降、攝食減少等反應，而同樣劑量飲用水灌胃的對照組小鼠未出現(xiàn)上述現(xiàn)象。雖然后面立即將灌胃量減半(每10 g體質(zhì)量0.15 mL劑量)，后逐步增加至預計灌胃量，小鼠精神、活動、體溫、攝食情況逐漸恢復，但由于上述應激反應發(fā)生是在小鼠斷乳后體質(zhì)量增長最快的階段，恢復期有1-2周，故影響了模型組小鼠的最終體質(zhì)量。也說明高脂食物對小鼠存在應激反應，自由攝食時，小鼠可以通過減少攝食量逐步適應，所以在灌胃造模時，應該由小量(每10 g體質(zhì)量0.15 mL劑量)在1周內(nèi)逐步增加至正常量(每10 g體質(zhì)量0.3 mL劑量)，以減小應激反應的影響。

肝臟病理學改變是診斷NAFLD最重要的診斷依據(jù)。本實驗中，模型組小鼠在第12周的肝臟病理片已經(jīng)表現(xiàn)出大量肝細胞(超過30%)體積增大，脂質(zhì)空泡，形成的典型NAFLD病理表現(xiàn)，16周時病理改變更加明顯，加上ALT及AST水平增高，充分說明已出現(xiàn)肝細胞炎癥壞死。血脂檢查結果表明，模型組高膽固醇血癥明顯，LDL水平升高比HDL水平降低表現(xiàn)得更加迅速、明顯。TG在模型組表現(xiàn)出下降的趨勢，與劉芳等[13]研究結果相同，但是原因不明，考慮為人類與老鼠的種屬差異性所致。綜合上述，基礎飼料聯(lián)合高脂腸內(nèi)營養(yǎng)液灌胃的方法能模擬人類NAFLD的發(fā)病過程，成功建造出穩(wěn)定的中重度NAFLD模型。

NAFLD目前確切發(fā)病機制雖尚不清楚，但固有免疫細胞在引發(fā)和加重NAFLD的病理過程中起到了關鍵作用卻是公認的[14]。除了之前研究較多的枯否細胞(Kupffer cells，KCs)、樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)、中性粒細胞外，近年來對NK細胞和NKT細胞在NAFLD中的作用日益受到重視。本研究中，與對照組相比，模型組CD4+T細胞比例有下降趨勢，但差異無顯著性，提示輔助性T細胞在NAFLD肝臟組織中的數(shù)目無明顯改變。與對照組相比，模型組肝臟NK細胞數(shù)有所增加，與肝臟ALT及AST水平改變一致，雖然差異無顯著性，與Dong等[15]發(fā)現(xiàn)的NK細胞在肝臟募集和激活后可以引起肝損傷，出現(xiàn)血清中ALT、AST輕度升高的結果一致。

NKT細胞是連接先天性免疫和獲得性免疫的橋梁，因能快速高效地生產(chǎn)Th1、Th2細胞因子，在病毒感染、腫瘤免疫、自身免疫性疾病中發(fā)揮作用[16]。在以往對NAFLD患者肝內(nèi)NKT細胞的研究發(fā)現(xiàn)，NKT細胞的數(shù)量及IL-4的分泌量增加[17]。本研究中，模型組NKT細胞的數(shù)量及IL-4+NKT百分比均增加，與對照組相比，差異具有顯著性，與NAFLD患者NKT細胞變化一致。以往的小鼠NAFLD模型研究提示，該疾病狀態(tài)下，NKT細胞數(shù)量是減少的，細究其原因，不能排除造模應用了膽堿缺乏飼料[11]或者基因缺陷的模型動物[18]所導致。本研究模型的制備模擬了最接近人類疾病發(fā)生、發(fā)展過程，在NKT細胞的數(shù)量及分泌活性方面符合NAFLD的病理改變，為該疾病的研究提供了良好的動物模型，并提示NKT細胞可能是治療該疾病的一個新靶點。

(致謝：感謝廣西醫(yī)科大學急診醫(yī)學實驗室、廣東科學院生物資源應用研究所及廣州醫(yī)科大學呼吸疾病國家重點實驗室的老師同學對本研究的大力支持及協(xié)助！)

[1] Rinella M E. Nonalcoholic fatty liver disease: a systematic review[J].JAMA, 2015,313(22):2263-73.

[2] Goh G B, McCullough A J. Natural history of nonalcoholic fatty liver disease[J].DigDisSci, 2016,61(5):1226-33.

[3] Younossi Z M, Blissett D, Blissett R, et al. The economic and clinical burden of nonalcoholic fatty liver disease in the United States and Europe[J].Hepatology, 2016,64(5):1577-86.

[4] 羅春華, 李國靜, 周 軍, 等. 宜昌市職業(yè)人群非酒精性脂肪性肝病流行病學調(diào)查及其與代謝綜合征相關性研究[J].重慶醫(yī)學,2016,45(3):390-2.

[4] Luo C H, Li G J, Zhou J, et al. Epidemiology investigation of nonalcoholic fatty liver disease in Yichang professional crowd and its correlation with the metabolic syndrome[J].ChongqingMedJ, 2016,45(3):390-2.

[5] 潘 磊, 張金彪, 崔榮崗, 等. 非酒精性脂肪肝C57BL/6小鼠模型的建立[J].中國組織工程研究,2016,20(40):6054-9.

[5] Pan L, Zhang J B, Cui R G, et al. Establishment of nonalcoholic fatty liver C57BL/6 mouse models[J].JClinRehabilTissueEngRes,2016,20(40):6054-9.

[6] 張園園, 周希喬. 腸道菌群與非酒精性脂肪肝研究進展[J].中華消化雜志,2016,36(11):790-2.

[6] Zhang Y Y, Zhou X Q. Research progress in intestinal flora and non-alcoholic fatty liver disease[J].ChinJDig,2016,36(11):790-2.

[7] 李曉沖, 張秀英, 徐 尚, 等. C57BL/6J小鼠非酒精性脂肪肝模型的建立[J].中國獸醫(yī)雜志,2013,49(1):6-8.

[7] Li X C, Zhang X Y, Xu S, et al. Establishment of models of non-alcoholic fatty liver in C57BL/6J mouse[J].ChinJVetMed,2013,49(1):6-8.

[8] 魏 偉,吳希美,李元建. 藥理實驗方法學[M]. 人民衛(wèi)生出版社,2010:496.

[8] Wei W, Wu X M, Li Y J. Experimental Methodology of Pharmacology[M]. People’s Medical Publishing House,2010:496.

[9] Chen Y P, Zhang J H, Li C Q, et al. Obesity enhances Th2 inflammatory response via natural killer T cells in a murine model of allergic asthma[J].IntJClinExpMed, 2015,8(9):15403-12.

[10] 陳一平, 姜曉紅, 封廣義, 等. 不同品系小鼠肥胖哮喘模型建立及比較[J].中國藥理學通報,2016,33(2):288-92.

[10] Chen Y P, Jiang X H, Feng G Y, et al. Establishment and comparison of obese asthma models in different strains of mice[J].ChinPharmacolBull,2016,33(2):288-92.

[11] Kremer M, Thomas E, Milton R J, et al. Kupffer cell and interleukin-12-dependent loss of natural killer T cells in hepatosteatosis[J].Hepatology, 2010,51(1):130-41.

[12] 王俊杰, 方會龍, 李純偉, 等. 非酒精性脂肪肝模型小鼠的建立[J].中國組織工程研究與臨床康復,2011,15(24):4395-9.

[12] Wang J J, Fang H L, Li C W, et al. Establishment of non-alcoholic fatty liver model in mice[J].JClinRehabilTissueEngRes,2011,15(24):4395-9.

[13] 劉 芳, 高南南, 楊潤梅, 等. 不同品系小鼠肥胖模型比較及C57BL/6J小鼠肥胖機制研究[J].中國藥理學通報,2013,29(3):360-5.

[13] Liu F, Gao N N, Yang R M, et al. Comparison of obesity models established in the different strains of mice and the mechanism of obese C57BL/6J mice[J].ChinPharmacolBull,2013,29(3):360-5.

[14] Arrese M, Cabrera D, Kalergis A M, et al. Innate immunity and inflammation in NAFLD/NASH[J].DigDisSci, 2016,61(5):1294-303.

[15] Dong Z, Wei H, Sun R, et al. Involvement of natural killer cells in PolyI:C-induced liver injury[J].JHepatol, 2004,41(6):966-73.

[16] Scheuplein F, Thariath A, Macdonald S, et al. A humanized monoclonal antibody specific for invariant natural killer T (iNKT) cells forinvivodepletion[J].PLoSOne, 2013,8(9):e76692.

[17] Tajiri K, Shimizu Y, Tsuneyama K, et al. Role of liver-infiltrating CD3+CD56+natural killer T cells in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease[J].EurJGastroenterolHepatol, 2009,21(6):673-80.

[18] Guebre-Xabier M, Yang S, Lin H Z, et al. Altered hepatic lymphocyte subpopulations in obesity-related murine fatty livers: potential mechanism for sensitization to liver damage[J].Hepatology, 2000,31(3):633-40.