SphK1抑制劑二甲基鞘氨醇抑制肺動脈平滑肌細胞增殖及遷移的作用及其可能機制

楊 姣，徐雙蘭，趙方允，張春芳，張鈺旋，劉麗瓊，邢西遷，吳緒偉

(1. 昆明醫科大學第一附屬醫院呼吸內一科，云南 昆明 650032；2. 昆明醫科大學附屬延安醫院呼吸內一科，云南 昆明 650051；3. 昆明醫科大學附屬延安醫院藥學部，云南 昆明 650051)

低氧性肺動脈高壓以肺血管阻力及肺動脈壓力增高為特征，是多種慢性心、肺疾病的病理生理過程，其中肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)的過度增殖引起肺小動脈管壁增厚、管腔狹窄所致的肺動脈壓力增高是重要的病理機制[1]。新近研究發現，鞘氨醇激酶1 (sphingosine kinase 1，SphK1)可調控細胞增殖、凋亡、遷移，其已成為治療腫瘤的新靶點[2]，但目前尚不清楚SphK1是否調控PASMCs的增殖、凋亡和遷移，從而調控肺動脈高壓的發生、發展。因此，我們擬應用SphK1的抑制劑二甲基鞘氨醇(N,N-dimethylsphingosine，DMS)干預低氧誘導的大鼠PASMCs,觀察其對PASMCs增殖、凋亡的作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物與試劑原代培養大鼠PASMCs，具體步驟參見文獻[3]。DMS、抗SphK1多克隆抗體、抗RhoA多克隆抗體、抗Rho激酶抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1MTT實驗 將細胞分為常氧組、低氧組、低氧+DMS(10 μmol·L-1)組。常氧組置于37℃、5% CO2、21% O2，低氧組置于37℃、5% CO2、1% O2培養箱恒溫培養。培養6、24、48、72 h后，按MTT試劑盒說明書檢測各組細胞的增殖情況。

1.2.2流式細胞儀檢測細胞凋亡 常氧組、低氧組和低氧+DMS(10 μmol·L-1)組細胞培養24 h后，參照細胞凋亡檢測試劑盒的說明書進行操作，以流式細胞儀檢測PASMCs的凋亡。

1.2.3劃痕法檢測細胞遷移 處理各組PASMCs，分別制備成單細胞懸液，以無菌200 μL的移液器吸頭劃痕，各組PASMCs分別處理24 h后，以倒置相差顯微鏡觀察劃痕邊緣細胞遷移情況并拍照，以Photoshop軟件分析PASMCs遷移程度。

1.2.4Western blot 蛋白免疫印跡分別檢測SphK1、RhoA、Rho激酶等蛋白的表達。

2 結果

2.1DMS抑制低氧誘導的PASMCs增殖6 h低氧對PASMCs的增殖無明顯促進作用，24 h低氧促進PASMCs細胞的增殖，且至低氧72 h，PASMCs增殖較常氧組更明顯(P<0.05)；而以10 μmol·L-1的DMS處理細胞后，6 h后細胞增殖較低氧組差異無顯著性，而24、48、72 h細胞增殖較低氧組明顯受到抑制，差異有統計學意義(P<0.05)，見Tab 1。

2.2DMS促進PASMCs凋亡流式細胞術檢測結果顯示，DMS處理低氧誘導的PASMCs后，可明顯促進PASMCs凋亡，與低氧組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

Tab 1 The proliferation inhibitory rate of PASMCs treated with n=5)

#P<0.05vsnormoxia;*P<0.05vshypoxia

2.3DMS抑制PASMCs遷移與常氧組相比，1%低氧24 h促進PASMCs遷移(57.3±5.6) μm(P<0.05)。與低氧組相比，低氧+DMS組PASMCs的遷移距離明顯減少(28.5±2.6) μm(P<0.05)。

2.4DMS抑制SphK1、RhoA、Rho激酶蛋白的表達與常氧組比較，低氧組PASMCs SphK1、RhoA、Rho激酶蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)。在10 μmol·L-1的DMS作用下，PASMCs的SphK1、RhoA、Rho激酶蛋白表達水平分別下降到低氧組的29%、43%、47%(P<0.01)。

3 討論

近年來的研究發現，鞘脂可通過調控細胞周期，在調控細胞凋亡等生物學行為中發揮重要作用[4]。SphKl是鞘脂的重要激酶，它可通過調控鞘脂代謝的平衡，促進細胞增殖、遷移[5]。本研究證實，低氧條件下培養的PASMCs中SphKl蛋白表達增加，而SphKl抑制劑DMS抑制低氧誘導的PASMCs增殖和遷移，且誘導其凋亡，并明顯抑制SphK1、RhoA、Rho激酶蛋白的表達，提示在低氧性肺動脈高壓發生中，DMS可能通過抑制SphK1、RhoA、Rho激酶的表達，發揮抗細胞增殖和遷移的潛能。我們前期研究表明，RhoA/Rho激酶信號通路在低氧性肺動脈高壓發生、發展及防治中發揮關鍵作用，Rho激酶抑制劑可有效降低低氧性肺動脈高壓大鼠模型和肺動脈高壓患者的肺動脈壓力[6]。因此，我們將進一步深入研究DMS通過調控RhoA/Rho激酶信號通路，調節PASMCs增殖、遷移的具體機制，從而為低氧性肺動脈高壓的防治提供新的靶點。

(致謝：本實驗是在昆明市延安醫院中心實驗室完成，對實驗過程給予指導和幫助的老師和同學表示感謝！)

[1] 蓋祥云, 林鵬程, 何彥峰, 等. 低氧性肺動脈高壓中低氧性肺血管收縮的作用[J]. 中國藥理學通報, 2016,32(6): 768-72.

[1] Ge X Y, Lin P C, He Y F, et al. Effect of hypoxic pulmonary vasoconstriction on hypoxic pulmonary hypertension[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(6): 768-72.

[2] Abramson H N. Kinase inhibitors as potential agents in the treatment of multiple myeloma[J].Oncotarget, 2016,7(49): 81926-68.

[3] 楊 姣, 吳緒偉, 張力燕, 等. 不同低氧時間誘導的大鼠肺動脈平滑肌細胞miR-199a表達的動態變化[J]. 國際呼吸雜志, 2015,35(7): 517-20.

[3] Yang J, Wu X W, Zhang L Y, et al. The expression changes of miR-199a in hypoxic-induced pulmonary artery smooth muscle cells of rat[J].IntJRespir, 2015,35(7): 517-20.

[4] Hatoum D, Haddadi N, Lin Y, et al. Mammalian sphingosine kinase (SphK) isoenzymes and isoform expression: challenges for SphK as an oncotarget[J].Oncotarget, 2017,8(22): 36898-929.

[5] Xing X Q, Li Y L, Zhang Y X, et al. Sphingosine kinase 1/sphingosine 1-phosphate signalling pathway as a potential therapeutic target of pulmonary hypertension[J].IntJClinExpMed, 2015,8(8): 11930-5.

[6] Xing X Q, Gan Y, Wu S J, et al. Rho-kinase as a potential therapeutic target for the treatment of pulmonary hypertension[J].DrugNewsPerspect, 2006,19(9): 517-22.