不同劑量單次照射下大鼠急性放射性心臟損傷模型的構建與評價

劉　陽，高世樂，胡宗濤，馬金柯，高　杉

放療是惡性腫瘤的綜合治療不可或缺的組成部分，食管癌、肺癌、乳腺癌、縱膈淋巴瘤等腫瘤組織在接受放射治療時，與腫瘤組織毗鄰的心臟也將受到不同劑量體積的照射，引起無或有臨床癥狀的放射性心臟損傷(radiation-induced heart disease RIHD)[1]。射線可破壞血管內皮細胞、微循環(huán)系統(tǒng)損傷、繼而使心肌出現缺血性改變、炎性細胞浸潤、局灶性或片狀心肌纖維化，最終導致心臟結構和功能損傷[2]。雖然因為放射治療技術的提高等因素，使心臟受照的劑量大大減少，但是射線造成的心臟損傷仍然不容忽視[3]。RIHD的各種并發(fā)癥對腫瘤患者的生活質量和生存期產生很大影響。目前臨床上對預防和治療RIHD尚無明確的共識。因此如何模擬臨床構建RIHD物實驗模型，揭示放射性心臟損傷發(fā)生的可能機制，對防治RIHD有非常重要的作用。為構建急性RIHD的實驗動物模型，該實驗通過不同劑量單次照射大鼠心臟，通過不同指標來評價所構建模型的科學性、可操作性，并探討大鼠氧化應激在RIHD中的作用，從而為下一步試驗提供科學、可行的動物模型。

1　材料與方法

1.1實驗動物清潔級SD(Sprague Dawley)雄性大鼠40只，8～12周，200～250 g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司。

1.2主要實驗試劑大鼠心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)試劑盒(批號：2016-11-01)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒(批號：2016-11-01)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒(批號：2016-11-01)購自南京建成生物工程研究所；Masson三色染色液(批號：616011)購自珠海貝索(BASO)生物技術有限公司。

1.3主要儀器與設備ELEKTA SYNERGY直線加速器(瑞典ELEKTA公司)；DL- BD動脈留置針(比迪醫(yī)療器械上海有限公司)；510型酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；15M低速冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；PT-100S生物血壓傳感器(成都泰盟軟件有限公司)；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱(嘉興中新醫(yī)療儀器有限公司)。

1.4實驗方法

1.4.1實驗大鼠分組40只SD雄性大鼠隨機分為5組：正常、 5 Gy、10 Gy、20 Gy、30 Gy組。

1.4.2照射方法各照射組大鼠用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔麻醉后，四肢固定，直線加速器下照射大鼠心臟，劑量率為200 cGy/min, 源皮距為100 cm，照射野2.0 cm×2.0 cm，照射后室溫下大鼠自然蘇醒，正常組大鼠只腹腔麻醉不做照射處理。

1.4.3一般狀況觀察動態(tài)觀察大鼠的毛發(fā)、體重、精神狀態(tài)。

1.4.4大鼠血流動力學指標測定于照射后1、4周末，各組隨機取4只大鼠。10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)，腹腔注射麻醉，固定后，將動脈留置針沿右側頸總動脈，插入左心室中，后通過生物血壓傳感器連接至生物機能實驗系統(tǒng)。記錄左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、室內壓最大上升速率(dp/dtmax)、室內壓最大下降速率(-dp/dtmax)等指標。采集大鼠血樣本置于EP管中，3 500 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液，-80 ℃條件下備用；處死大鼠后分離心臟組織，將心尖部組織置于10%中性福爾馬林溶液中固定備用。

1.4.5大鼠血清中cTnI含量的測定嚴格按照試劑盒說明書準備，加入樣品和標準品，37 ℃水浴鍋溫育60 min；重復洗板5次；將底物A、 B各50 μl加入每孔中， 37 ℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μl，15 min內，在450 nm 波長處測定各孔的光密度(optical density，OD)值。

1.4.6大鼠血清中SOD和MDA活性測定嚴格按照試劑盒說明書準備，按其說明書步驟進行。

1.4.7大鼠心臟組織HE染色心尖部組織常規(guī)脫水、透明、包埋、切片，厚5 μm，HE染色，中性樹膠封片。

1.4.8大鼠心臟組織Masson染色取心臟組織，經常規(guī)石蠟包埋，切片后脫蠟至水。Weigert鐵蘇木素(A液和B液等比例混合)染5～10 min，流水稍洗。1%鹽酸酒精分化，流水沖洗數分鐘。麗春紅酸性品紅染液染5～10 min，流水稍沖洗。磷鉬酸溶液處理約5 min，不用水洗，直接用苯胺藍染液復染5 min。1%冰醋酸處理1 min，95%酒精脫水多次。無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2　結果

2.1一般狀況實驗期間，正常組大鼠進食飲水正常、毛發(fā)無脫落、精神尚可。各照射組大鼠有精神不佳、飲食減少、體重增加減慢等表現，其中20 Gy、30 Gy組較5 Gy、10 Gy組嚴重，并且30 Gy組大鼠在實驗期間死亡1只，30 Gy組部分大鼠實驗期間可觀察到照射野區(qū)域毛發(fā)減少，皮膚破潰后結痂等。見圖1。

圖1　30 Gy劑量照射組大鼠皮膚外觀變化情況

2.2心臟血流動力學參數照射后1周，與正常組比較，各照射劑量組心臟血流動力學指標無明顯變化(P>0.05)；照射后4周，與正常組比較，5 Gy、10 Gy組心臟血流動力學指標無明顯變化，20 Gy和30 Gy組心臟血流動力學指標變化明顯(P<0.05)，兩組間變化不明顯。見圖2、3。

2.3血清cTnI含量照射后1周，與正常組比較，各照射組大鼠血清中cTnI含量明顯升高(P<0.05)；組間比較，20 Gy和30 Gy組cTnI含量都較5 Gy和10 Gy組明顯升高(P<0.05)。受照4周后，與對照組比較，血清中cTnI含量明顯升高(P<0.05)；各組間比較顯示cTnI含量隨劑量升高而升高(P<0.05)。見表1。

2.4血清SOD、MDA活性照射后1周，與正常組相比，各劑量組MDA指含量顯升高(P<0.05)；SOD活性明顯降低(P<0.05)。照射后4周，與正常組比較，各劑量組SOD指標明顯降低、MDA指標明顯升高(P<0.05)；組間比較顯示：20 Gy和30 Gy組SOD活性較5 Gy和10 Gy組明顯升高(P<0.05)；MDA含量隨劑量升高而升高(P<0.05)。見表2。

2.5心臟HE、Masson染色

2.5.1HE染色光學顯微鏡100倍視野下正常組大鼠心肌細胞呈長條有序排列，胞質淡紅色，核深藍色，心肌結構無明顯損傷。受照1周后，與正常組比較，各照射組大鼠心肌改變不明顯；受照4周后，與正常組比較，各照射組均有不同程度的細胞水腫、炎性細胞浸潤、以及部分心肌細胞斷裂。見圖4、5。

2.5.2Masson染色可觀察到心肌纖維呈紅色，膠原纖維呈淡藍色，細胞核呈藍黑色。照射后4周后，光學顯微鏡200倍視野，可見較正常組增多的膠原纖維主要分布于心肌細胞間質和血管周圍。見圖6。

表1　1和4周末大鼠血清中cTnI含量

與正常組比較：#P<0.05；與20 Gy組比較：*P<0.05

圖2　1周末大鼠心臟血流動力學參數變化

項目正常組5 Gy組10 Gy組20 Gy組30 Gy組F值SOD(U/ml) 1周190.52±9.65151.29±14.94#145.69±18.80#123.28±9.65#108.33±40.69#7.28 4周196.97±14.72161.45±22.69#*155.75±9.80#*127.26±12.98#106.36±34.53#10.94MDA(nmol/ml) 1周4.15±0.284.94±0.22#*5.63±0.14#*7.22±0.40#8.42±0.14#*184.00 4周4.03±0.244.56±0.28#*5.24±0.16#*6.85±0.21#7.54±0.28#*152.70

與正常組比較：#P<0.05；與20 Gy組比較：*P<0.05

圖3　4周末大鼠心臟血流動力學參數變化

A:4周末LVSP；B:4周末LVEDP；C:4周末dp/dtmax；D:4周末-dp/dtmax；與正常組比較：#P<0.05；與20 Gy組比較：*P<0.05

圖4　1周末大鼠心臟病理組織學變化　HE×100

圖5　4周末大鼠心臟病理組織學變化　HE×100

圖6　4周末大鼠心臟病理組織學變化　Masson×200

3　討論

有文獻[4]報道，心臟在遭受20 Gy劑量單次照射后即可產生不可逆性損傷，因此本實驗通過觀察不同劑量照射構建模型造成不同損傷的特點，從而為下一步試驗提供科學、可行的動物模型。

在構建大鼠RIHD模型的實際操作過程中如何較為簡易地確定大鼠心臟在體表的位置，盡可能縮小照射野的范圍，對后續(xù)實驗舉足輕重。本研究隨機抽取小部分大鼠(5只)，利用心臟超聲，來估測大鼠心臟在體表定位，大致為以大鼠兩上肢水平連線和胸正中線交點下2～3 cm處為中心點，做2 cm×2 cm正方形。

在照射后早期，心臟自身具有一定程度抵抗外界刺激的代償機制，心臟收縮和舒張功能改變不明顯。然而照射后心臟損傷始終存在，隨著觀察時間增加，收縮和舒張功能明顯降低，并且和劑量呈正相關性。文獻[4]報道，構建急性RIHD模型時，小于10 Gy劑量的照射不會導致心臟功能的變化，大于20 Gy的照射劑量更為適合。隨著實驗時間節(jié)點的進一步延長，低劑量組是否會出現心臟損傷，有待于進一步實驗證實。

作為晚反應組織的心臟，心肌細胞更新較慢，可以在一定程度上耐受射線直接或間接的照射[5]。有文獻[6-7]證實，急性RIHD，一般多見于照射后1個月內，以心肌細胞水腫、炎性細胞浸潤、纖維蛋白滲出為主，而心肌細胞纖維化發(fā)生緩慢。本實驗病理HE染色可觀察到照射早期急性期心肌細胞病理改變并不明顯，照射4周后有不同程度的心肌細胞損傷；Masson染色結果同樣也證實心肌纖維化的發(fā)生具有時間相關性。

心肌酶中以cTnI對診斷早期放射性心臟損傷的敏感性和特異性較高，心肌損傷后出現時間早，持續(xù)時間長，優(yōu)于cTnT、CK、CK-MB[8-10]。本實驗結果顯示，cTnI含量的改變與照射劑量具有正相關性。

機體內氧自由基與抗氧化物質始終處于相對的動態(tài)平衡，是機體內機體內穩(wěn)態(tài)的重要組成部分[11]。SOD和MDA是檢測機體內氧化和抗氧化水平的重要指標[12]。電離輻射所致的氧化應激對心肌細胞影響較大[13]，當大鼠心肌細胞受到電離輻射刺激時，氧化及抗氧化失衡，導致SOD含量降低，MDA含量升高，并且與照射劑量具有正相關性。

綜上所述，心臟損傷的嚴重程度與劑量相關，不同劑量單次照射構建大鼠急性RIHD模型有不同特征。5 Gy和10 Gy照射組，在氧化應激和心肌酶指標上差異明顯，而心功能變化不明顯，20 Gy和30 Gy照射組在各檢測指標上都有明顯差異，30 Gy照射組有一定死亡率，并且在某些指標和20 Gy相比改變不明顯，綜合考慮20 Gy照射可較好的評估急性RIHD情況。氧化應激在RIHD的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，但后續(xù)的信號傳導通路有待實驗進一步證實。